Si può localizzare una mutazione legata al cancro? Teach article

Tradotto da Kalina K.Stantcheva. In che modo si sviluppa il cancro, e come fanno i genetisti ad affermare che una cellula è cancerosa? Questa attività di insegnamento sviluppata dal Communication and Public Engagement team del Wellcome Trust Sanger Institute, UK, risponde a questa e ad altre…

Tutti i tipi di cancro hanno origine da cambiamenti nella sequenza di DNA in alcune delle nostre cellule. Il materiale genetico all’interno delle cellule è esposto all’azione di mutageni come le radiazioni UV, per cui può accumulare errori durante la replicazione. A volte, una di queste mutazioni può alterare la funzione di un gene chiave, avvantaggiando la crescita della cellula in cui ha avuto luogo e di quelle da essa derivanti; il tasso di divisione di queste cellule sarà maggiore rispetto a quelle che le affiancano.

Gradualmente, il DNA acquisirà altre mutazioni che possono portare alla distruzione di altri geni chiave, risultando in cellule ad alto tasso di crescita ed invasività. Il risultato è la formazione di un tumore, l’invasione del tessuto circostante e, alla fine, la formazione di metastasi, cioè la diffusione del cancro in altre parti del corpo.

I geni che, quando mutati, portano allo sviluppo di un cancro sono chiamati “geni connessi al cancro”.

I geni oncosoppressori (tumor suppressor genes – TSGs; Figura 1) codificano per proteine che normalmente rallentano la crescita cellulare, impedendo la divisione cellulare quando non è necessaria o promuovendo l’apoptosi (morte cellulare programmata) nel caso in cui il DNA della cellula sia danneggiato. Entrambe le copie di un gene oncosoppressore dovrebbero essere inattivate da una mutazione affinchè il controllo del ciclo cellulare venga meno. Se vi è una copia funzionale¸ il “freno” alla crescita cellulare rimane.

I proto-oncogeni, al contrario, codificano per proteine che promuovono la divisione e differenziazione cellulare (specializzazione). Quando questi geni acquisiscono mutazioni che rendono le proteine perennemente attive o impediscono la regolazione dell’attività genica, essi diventano oncogeni, promuovono cioè la crescita e la divisione cellulare incontrollata. Per i proto-oncogeni, una mutazione in una sola copia del gene può essere sufficiente per innescare lo sviluppo di un cancro.

Ogni singolo caso di cancro è causato da un unico set di mutazioni nei proto-oncogeni e/o oncosoppressori. Nonostante il numero esatto non sia ancoro noto, si pensa che siano necessarie cinque o più mutazioni nei geni connessi al cancro affinchè una cellula (e le cellule che da essa derivano) diventi cancerosa.

KRAS (pronunciato kay-rass) è un proto-oncogene che codifica per la proteina KRAS, una proteina segnale intracellulare coinvolta nella promozione della crescita cellulare (per distinguere i geni dalle proteine, i nomi dei geni sono per convenzione scritti in italics). L’esercitazione descritta qui di seguito permette agli studenti di utilizzare dati genomici reali provenienti dal Progetto Genoma Canro (Cancer Genome Project^w1) per studiare mutazioni comuni nel gene KRAS associate ad oncogenesi (formazione del tumore) e allo sviluppo di tumori pancreatici, colorettali, polmonari ed altri. Sviluppata originariamente per visite di studenti delle scuole al Sanger Institute^w2, l’attività è stata resa accessibile attraverso il sito Yourgenome.org^w3. Recentemente essa ha costituito parte del primo corso di bioinformatica per insegnanti europei condotto da ELLS^w4 presso l’European Bioinformatics Institute^w5 in Hinxton, UK. L’attività, nel suo insieme, stimola la discussione circa le cause dell’insorgenza del cancro, la funzione delle mutazioni geniche, la struttura e la funzione delle proteine.

L’esercitazione su KRAS

Durata stimata: 45-60 minuti (con presentazione e discussione)

Materiale

Tutto il materiale richiesto per svolgere l’attività può essere scaricato gratuitamente dal sito Yourgenome.org, sia singolarmente che come file zip compresso^w6.

• Un insieme di 11 fogli di lavoro (KRAS_student_wsheet.pdf) – un foglio di lavoro per coppia o per gruppo di studenti. Una versione alternativa è disponibile per stampanti in bianco e nero o per l’utilizzo da parte di studenti daltonici. Per gruppi numerosi (20 o più persone), usare 2 insiemi di fogli di lavoro.

• Un cartellone con la sequenza del gene KRAS (KRAS_gene_banner.pdf) per l’intera classe, ed un foglio con il gene KRAS (KRAS_genesheet_yg.pdf; Figura 3) per ogni gruppo di studenti. Il foglio con il gene (stampato in formato A3 o A4) necessita di un breve tempo di preparazione. Il cartellone con KRAS, stampato su diversi fogli di carta che devono poi essere attaccati, rende possibile visualizzare i risultati di tutta la classa simultaneamente.

• Un diagramma circolare che permette di associare un amminoacido ad ogni codone (KRAS_codon_wheel.pdf) o qualsiasi altra tavola per decifrare i codoni del DNA, da 5’ a 3’) per gruppo (vedere figure 4 e 5)
• Un foglio riassuntivo (KRAS_ data_sheet.pdf) per gruppo
• Penne

Per usare il cartellone ci sarà bisogno di grandi frecce per localizzare le mutazioni nella sequenza del gene, quadrati per marcare le regioni che sono state controllate (KRAS_annotations.pdf), e adesivi riutilizzabili (per esempio Blu Tack®) per attaccare frecce e quadrati sul cartellone della sequenza genica. Per maggiori informazioni su come utilizzare questo metodo leggete le annotazioni per gli insegnanti scaricabili dal sito^w6.

Inoltre, potrebbe essere utile avere a portata di mano modelli di DNA, peptidi e/o proteine ed utilizzare le animazioni riguardanti il cancro del Wellcome Trust Sanger Institute (Cancer: Rogue cells e Role of cancer genes) presenti sul sito dell’esercitazione riguardante KRAS^w6.

Introduzione all’esercitazione

La presentazione “Investigating cancer” (disponibile online^w6) fornisce agli studenti un idea generale sul cancro. Introduce il concetto che il cancro si sviluppa in seguito ad anormalità nella sequenza del DNA, spiega le varie cause di queste mutazioni e introduce le esercitazioni e le attività. Numerose parti della presentazione incoraggiano gli studenti alla discussione (vedere le annotazioni sulla presentazione^w6).

Nella prima parte dell’esercitazione gli studenti devono identificare le differenze tra la sequenza del gene KRAS in cellule sane e tumorali sui loro fogli di lavoro e segnarle sul cartellone di KRAS o sul foglio con la sequenza del gene.

I fogli di lavoro contengono i grafici della sequenza di DNA di KRAS di campioni cellulari sani e cancerosi, rappresentati da un insieme di linee colorate, una per ogni regione del gene. Le quattro basi sono rappresentate su questi grafici da 4 colori diversi. Ogni picco colorato rappresenta una singola base di DNA:

Rosso: T

Verde: A

Blu: C

Nero: G (originariamente questi picchi sono gialli ma questo colore non è facilmente leggibile sulla carta)

In totale ci sono 11 fogli di lavoro numerati, ognuno rappresentante 2 diverse regioni del gene KRAS. Le sei mutazioni tipiche del gene KRAS si trovano sui fogli da uno a sei, per cui assicuratevi di mischiare i fogli prima di distribuirli alla classe. Devono essere tutti completi per assicurare una copertura totale del gene. È importante puntualizzare davanti agli studenti che le mutazioni sono (relativamente) rare, per cui non tutti ne troveranno una; questo fatto può essere utilizzato per discutere l’importanza dei dati negativi e di un’analisi esauriente negli studi scientifici.

Identificazione delle mutazioni

Utilizzando i fogli di lavoro, gli studenti confronteranno una parte di sequenza di DNA di una cellula sana con quella di una cellula tumorale presa dallo stesso paziente. Il modo più semplice per verificare se è avvenuta una mutazione è quello di scrivere la sequenza di DNA sotto i picchi colorati (sul foglio c’è una legenda) e comparare le sequenze scritte.

Se una delle lettere appare diversa (il picco ha cambiato colore), vuol dire che vi è una mutazione nella sequenza. Nella Figura 7 (a destra), la A nella sequenza di DNA presa dalla cellula sana è stata sostituita da una G nella cellula tumorale.

Se gli studenti trovano un doppio picco in corrispondenza di una singola base, entrambe le basi presenti in quella posizione devono essere annotate, una sopra l’altra. Nella Figura 8, la sequenza del DNA sano mostra una G, mentre la sequenza tumorale mostra sia una G che una C. Non si tratta di un’inserzione ma piuttosto di una mutazione eterozigote dove solo in una copia del gene la C ha sostituito la G. In questo caso la sequenza tumorale ha una C al posto della G.

Tutti gli studenti devono indicare le regioni geniche che hanno controllato contrassegnando la parte in questione sul foglio dove è illustrata la sequenza del gene (vedi Figura 9, a sinistra).

Gli studenti che trovano una mutazione devono indicare la base specifica cerchiandola sul foglio (vedi Figura 9) ed annotare in quale codone si trova (in questo esempio, il codone 12).

Gli studenti devono inoltre riempire la tabella in fondo al foglio di lavoro, utilizzando il diagramma circolare per tradurre la sequenza di DNA in amminoacidi, come mostrato nella Tabella 1:

Quando tutte le mutazioni sono state individuate, segnarle sul foglio riassuntivo dei dati (vedi Tabella 2).

Discussing the results

The results above are all single base substitutions. These mutations within the protein-coding region of the KRAS gene may be classified into one of three types, depending on the information encoded by the altered codon.

• Silent mutations code for the same amino acid.
• Missense mutations code for a different amino acid.
• Nonsense mutations code for a stop and can truncate the protein.

Discuss whether the mutations are significant – will they have an impact on protein function or are they ‘silent’? In this activity, codons 30 and 173 are silent and therefore do not have a functional impact.

La presentazione contiene un’immagine 3D della proteina KRAS da riempire (Figura 10, a destra); le diapositive 26-30 mostrano dove si trovano le mutazioni significative all’interno della proteina e potrete notare che si trovano tutte nella stessa regione. I codoni 12, 13 e 61 sono state le prime mutazioni ad essere associate a trasformazioni oncogeniche nella proteina KRAS; la mutazione 146 è stata scoperta solo nel 2005. Potete utilizzare queste diapositive per discutere l’impatto che le mutazioni potrebbero avere sulla struttura e sulla funzione della proteina KRAS.

Come esercitazione opzionale, gli studenti possono utilizzare RasMol, il software di modellazione molecolare che è stato usato per creare le immagini delle diapositive 26-30, per evidenziare all’interno della struttura proteica gli amminoacidi mutati. Vedi le note per gli insegnanti^w6 per ulteriori dettagli.

In che modo un’informazione come questa influenza il nostro approccio al cancro?

Le note per gli insegnanti^w6 contengono una grande quantità di informazioni di base che, sfruttando KRAS come esempio, possono stimolare la discussione su come l’informazione genetica possa essere utilizzata per capire più a fondo il cancro e per sviluppare trattamenti per esso. I punti di discussione per gli studenti sono i seguenti:

• Quali esperimenti o approcci potrebbero essere usati per stabilire in quali tipi di cancro sono coinvolte le mutazioni di KRAS?
• Quali potrebbero essere i vantaggi di avere questa informazione?
• Il cancro è una malattia genetica: è il risultato di cambiamenti nella sequenza del DNA. É questo il motivo per cui molte persone credono che finanziare la ricerca nel campo della genetica del cancro sia il miglior modo per sviluppare nuovi trattamenti per tale malattia. Sia i nuovi trattamenti per i tumori che l’assistenza ai pazienti richiedono una grande quantità di soldi (il Servizio Sanitario Nazionale della Gran Bretagna ha speso nel 2000 più di 2 miliardi di sterline solo in questo ambito). In cosa e come gli studenti pensano che debbano essere spesi i soldi?

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