Γενετική αποτύπωση: μία ενδότερη ματιά Understand article

Μετάφραση από τον Παναγιώτης Στασινάκης (Panagiotis Stasinakis). Στις δημοφιλείς τηλεοπτικές σειρές με ντετέκτιβ, η γενετική αποτύπωση συχνά χρησιμοποιείται για την…

Η ιδέα της ταυτοποίησης των ανθρώπων βάση των γενετικών τους χαρακτηριστικών, δεν είναι νέα. Το σύστημα ομάδων αίματος ΑΒΟ, ανακαλύφθηκε το 1900 από τον Karl Landsteiner^w1 και έγινε ο πρώτος γενετικός δείκτης που χρησιμοποιήθηκε στην εγκληματολογία, αργότερα θα συμπληρωθεί με τις ομάδες αίματος MN (1927) και τον παράγοντα Ρέζους (1937).

Ακόμα και όταν αναλύουμε ταυτόχρονα τα τρία συστήματα ομάδων αίματος, περίπου ένας στους δέκα ανθρώπους δίνει παρόμοια αποτελέσματα: αυτό κάνει δυνατές τις μεταγγίσεις αίματος. Για τους σκοπούς της ιατροδικαστικής, ωστόσο, αυτό είναι ένα μειονέκτημα: τα αποτελέσματα μπορούν να σας πουν ότι το δείγμα αίματος που έχετε δεν προέρχεται από τον Ύποπτο Χ, αλλά δεν μπορούν να σας πουν σε μεγάλο βαθμό βεβαιότητας ότι προέρχεται από τον Ύποπτο Ψ.

Ακόμα και όταν αναλύουμε ταυτόχρονα τα τρία συστήματα ομάδων αίματος, περίπου ένας στους δέκα ανθρώπους δίνει παρόμοια αποτελέσματα: αυτό κάνει δυνατές τις μεταγγίσεις αίματος. Για τους σκοπούς της ιατροδικαστικής, ωστόσο, αυτό είναι ένα μειονέκτημα: τα αποτελέσματα μπορούν να σας πουν ότι το δείγμα αίματος που έχετε δεν προέρχεται από τον Ύποπτο Χ, αλλά δεν μπορούν να σας πουν σε μεγάλο βαθμό βεβαιότητας ότι προέρχεται από τον Ύποπτο Ψ.

Η γενετική μας σύνθεση – ποιοι είμαστε

Το ανθρώπινο γονιδίωμα αποτελείται από 46 ζεύγη χρωμοσωμάτων: 23 από τη μητέρα μας, 23 από τον πατέρα μας. Έχουμε λοιπόν δύο από κάθε χρωμόσωμα (εκτός – στην περίπτωση των ανδρικών φυλετικών χρωμοσωμάτων) και ως εκ τούτου δύο αντίγραφα κάθε γονιδίου.

Το κύριο συστατικό των χρωμοσωμάτων είναι το δεσοξυριβονουκλεϊνικό οξύ (DNA), το οποίο περιέχει πληροφορίες για την κατασκευή των πρωτεϊνών που χρειάζονται για τη ζωή. Ωστόσο, από τα 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων μας (bp), μόνο το 4% περίπου στην πραγματικότητα κωδικοποιεί για την παραγωγή πρωτεΐνών: το υπόλοιπο είναι συχνά απλώς «γέμισμα» που αποτελείται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες που οργανώνονται σε ομάδες. Αν συγκρίνουμε τα DNA δύο ανθρώπων, στο μεγαλύτερο μέρος τους είναι ίδια, με τη μεταβλητότητα να εντοπίζεται σε μεγάλο βαθμό σε αυτές τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες.

Διαφορετικοί άνθρωποι μπορεί να έχουν διαφορετικό αριθμό επαναλήψεων αυτών των αλληλουχιών: ένα άτομο μπορεί να έχει πέντε επαναλήψεις σε έναν συγκεκριμένο τόπο DNA (θέση). Ένα άλλο άτομο μπορεί να έχει επτά. Χρησιμοποιώντας δείγματα, π.χ. από το αίμα ή το σπέρμα, μπορούμε να αναλύσουμε τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες σε διάφορους τόπους DNA. Ονομάζουμε αυτή την ανάλυση μία ανάλυση γενετικού αποτυπώματος. Όπως τα δακτυλικά αποτυπώματα, τα γενετικά αποτυπώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση ατόμων.

Μολονότι ο όρος «γενετικό αποτύπωμα» (ή γενετικό προφίλ) χρησιμοποιείται συχνά, δεν γνωρίζουν όλοι πως στην πραγματικότητα περιλαμβάνει δύο πολύ διαφορετικές τεχνικές, από τις οποίες μόνο μία χρησιμοποιείται συνήθως στην εγκληματολογία σήμερα.

Πρόωρη γενετική αποτύπωση: πολυμορφισμός μήκους καθοριζόμενου από περιοριστική ενδονουκλεάση

Η πρώτη μέθοδος γενετικών αποτυπωμάτων επινοήθηκε το 1984 από τον Alec Jeffreys^w2, ο οποίος χρησιμοποίησε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που είναι γνωστές ως μεταβλητός αριθμός διαδοχικών επαναλήψεων (VNTRs; π.χ. η αλληλουχία D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n). Αυτές οι αλληλουχίες, 10-100 ζεύγη βάσεων (bp) ανά επανάληψη, μπορούν να διαπιστωθούν με τη χρήση ενζύμων περιορισμού, τα οποία λειτουργούν σαν μοριακά ψαλίδια που κόβουν το DNA σε προκαθορισμένες αλληλουχίες (αλληλουχίες αναγνώρισης). Σε ολόκληρο το γονιδίωμα μας, μία ακολουθία αναγνώρισης 6 ζευγών βάσεων (bp) θα υπάρχει περίπου 730.000 φορές.

Αυτό σημαίνει ότι αν κόψετε το γονιδίωμα με ένα συγκεκριμένο ένζυμο περιορισμού, θα πάρετε περίπου 730.000 τμήματα- θραύσματα –  περιορισμού ποικίλου μήκους. Και αυτό το σημείο που τα VNTRs γίνονται σημαντικά: ο αριθμός των επαναλήψεων σε ένα συγκεκριμένο σύμπλεγμα VNTR μπορεί να ποικίλει μεταξύ των ατόμων, πράγμα που σημαίνει ότι το μήκος του αντίστοιχου θραύσματος περιορισμού θα ποικίλλει αρκετά μεταξύ των ατόμων (Σχήμα 1). Ονομάζουμε αυτό το φαινόμενο πολυμορφισμός μήκους θραύσματος περιορισμού (restriction fragment length polymorphism – RFLP).

Από τα 730.000 θραύσματα περιορισμού, μόνο μερικά θα διαφέρουν μεταξύ των ατόμων – πολύ λίγα για να ανιχνευθούν με το γυμνό μάτι. Αντ ‘αυτού, οι επιστήμονες χρησιμοποίησαν μια τεχνική που ονομάζεται στύπωμα Southern, η οποία επιτρέπει την απεικόνιση μόνο των αλληλουχιών που παρουσιάζουν κάποιο ενδιαφέρον. Για να γίνει αυτό, διαχωρίζουν τα θραύσματα περιορισμού ανάλογα με το μέγεθος τους με τη χρήση πηκτώματος ηλεκτροφόρησης, χρησιμοποιώντας ηλεκτρικό ρεύμα για να μετακινηθούν τα φορτισμένα μόρια του DNA διαμέσου ενός πηκτώματος. Η απόσταση που διανύεται, προσδιορίζεται από το μέγεθος του θραύσματος (Σχήμα 2, Στάδιο 1). Στη συνέχεια, μεταφέρουν το DNA σε μια μεμβράνη (Εικόνα 2, Βήμα 2) και εφαρμόζουν ένα ραδιενεργά σημασμένο ανιχνευτή που είναι συμπληρωματικός προς το VNTR(s) που τους ενδιαφέρει. Ο ανιχνευτής υβριδοποιείται (κολλάει) στις αντίστοιχες αλληλουχίες (Σχήμα 2, Βήμα 3) και με την τοποθέτηση της μεμβράνης σε ένα φιλμ ακτίνων Χ, οι επιστήμονες παίρνουν μια εικόνα ραδιενεργώς σημασμένων ζωνών, καθεμία από τις οποίες αντιπροσωπεύει ένα διαφορετικό μήκος του θραύσματος (Εικόνα 2, Στάδιο 4). Αυτή η εικόνα είναι το γενετικό αποτύπωμα.

Επομένως, πόσα VNTRs χρειάζονται να συγκριθούν για να προσφέρουν μία αξιόπιστη διαφοροποίηση μεταξύ των ατόμων; Αν οι επιστήμονες επιλέξουν VNTRs με αρκετή ποικιλία (π.χ. το D1S80, η οποία μπορεί να επαναληφθεί από 15 έως 41 φορές), χρειάζεται να συγκρίνετε μόνο τέσσερα διαφορετικά VNTRs προσφέροντας μία ισχύς διάκρισης του 1:1 εκατομμυρίων, σαφώς πολύ καλύτερα από ότι το 1: 10 που προσφέρονται από το σύστημα ΑΒΟ των ομάδων αίματος.

Η σημερινή τεχνική: γενετικά αποτυπώματα που στηρίζονται στην PCR

Ο Kary Mullis ανακάλυψε το 1983, την αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), που του χάρισε το βραβείο Νόμπελ στη Χημεία ^w3, ^w4. Αυτή η εφεύρεση, μαζί με την ανακάλυψη στα τέλη της δεκαετίας του 1980 των σύντομων διαδοχικών επαναλήψεων (STRs – short tandem repeats) – 2-9 ζεύγη βάσεων (bp) επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, που ονομάζονται επίσης μικροδορυφόρων – άνοιξαν το δρόμο για την υψηλής ταχύτητας τεχνολογία γενετικής αποτύπωσης, που χρησιμοποιούν σήμερα οι ιατροδικαστές.

Το PCR επιτρέπει σε έναν τόπο DNA που μας ενδιαφέρει (π.χ. οι 4 ζευγών βάσεων (bp) STR, γνωστή ως D18S51, (AGAA)_n), να ενισχυθεί εκθετικά, δημιουργώντας σε λίγες μόνο ώρες ένα δισεκατομμύριο αντίγραφα από ένα μόνο μόριο DNA (Εικόνα 3). Για τους ιατροδικαστές, αυτό έχει το πλεονέκτημα πως είναι δυνατή η ανάλυση ακόμη και πολύ μικροσκοπικών δειγμάτων – τόσο λίγο όσα 30 κύτταρα (βλέπε Πίνακα 1 για μια σύγκριση του σχετικού με RFLP γενετικό αποτύπωμα).

Για την ανάλυση PCR, χρειαζόμαστε STRs που πλευρίζονται από αλληλουχίες που είναι ταυτόσημες σε όλα τα ανθρώπινα όντα (αυτές τις αλληλουχίες τις λέμε συντηρημένες). Στη συνέχεια, χρησιμοποιούμε εκκινητές – μικρά μόρια που είναι συμπληρωματικά προς τις συντηρημένες πλευρικές αλληλουχίες (γονίδια 1134 και 1135 στο Σχήμα 4) – για την κίνηση της PCR. Μόλις το DNA έχει ενισχυθεί, μπορούμε να το διαχωρίσουμε είτε με πήκτωμα ηλεκτροφόρησης (Σχήμα 5), ή, στη σύγχρονη ιατροδικαστική επιστήμη, με ηλεκτροφορητική αυτοματοποιημένη αλληλούχιση (Σχήμα 6), και απεικόνισή της ως ένα γενετικό αποτύπωμα.

Έχουμε δύο αντίγραφα από κάθε χρωμόσωμα, έτσι έχουμε επίσης δύο αντίγραφα κάθε STR. Εάν, για κάθε ένα αντίγραφο της STR, κάποιος έχει τον ίδιο αριθμό επαναλήψεων (δηλαδή το ίδιο αλληλόμορφο), η ανάλυση PCR αποκαλύπτει μόνο ένα μέγεθος του θραύσματος DNA: το άτομο είναι ομόζυγο για το αλληλόμορφο STR (πράσινο βέλος στο Σχήμα 5, που αντιστοιχεί στο άτομο 2 στο Σχήμα 4). Εάν τα δύο χρωμοσώματα φέρουν μη-ταυτόσημα αλληλόμορφα για την συγκεκριμένη STR, βλέπουμε δύο μεγέθη του θραύσματος και λέμε πως το άτομο είναι ετερόζυγο (κόκκινο βέλος στο Σχήμα 5, που αντιστοιχεί στο άτομο 1 από το Σχήμα 4).

Αν αναλύσουμε μόνο ένα STR, η πιθανότητα δύο άσχετα άτομα να έχουν το ίδιο γενετικό αποτύπωμα που βασίζεται σε PCR, είναι υψηλή – μεταξύ 1:2 και 1:100 (μπλε βέλη στο Σχήμα 5). Αυτό συμβαίνει επειδή τα STRs έχουν λιγότερα αλληλόμορφα και χαμηλότερη ετεροζυγωτία σε σχέση με τα VNTRs που χρησιμοποιούνται στην γενετική αποτύπωση βάση των RFLP. Για να ξεπεραστεί αυτό το μειονέκτημα, αναλύουμε πολλά STRs ταυτόχρονα: με 16 STRs, όπως συνηθίζεται στις ιατροδικαστικές υποθέσεις στη Γερμανία, μπορούμε να επιτύχουμε μια ισχύς της διάκρισης των 1:10 δισεκατομμυρίων (που ισοδυναμεί με ένα άτομο στον πληθυσμό του πλανήτη, Σχήμα 6).

Εφαρμογές των γενετικών αποτυπωμάτων

Τώρα ξέρουμε τι είναι τα γενετικά αποτυπώματα, αλλά πώς χρησιμοποιούνται; Η γενετική αποτύπωση που βασίζεται στο PCR εφαρμόζεται ευρέως στις ιατροδικαστικές έρευνες: αυτό επιτρέπει στην αστυνομία να αποκλείσει ή να ταυτοποιήσει υπόπτους στη βάση του γενετικού υλικού, όπως θύλακες των τριχών, δέρμα, σπέρμα, σάλιο ή αίμα (δείτε την ιστορία που μπορείτε να κατεβάσετε παρακάτω^w5). Ένα γενετικό αποτύπωμα και μόνο, όμως, δεν είναι επαρκές αποδεικτικό στοιχείο για την καταδίκη, καθώς στενοί συγγενείς μπορεί να έχουν πολύ παρόμοια αποτυπώματα (και μονοζυγωτικά δίδυμα θα έχουν κανονικά τα ίδια).

Και για να περιπλέξουν τις διεθνείς εγκληματολογικές έρευνες, αν και υπάρχει μια ευρωπαϊκή σύσταση για την ανάλυση 16 STRs, κάθε χώρα μπορεί να αποφασίσει ποια STRs να αναλύσει, γεγονός που καθιστά δύσκολες τις συγκρίσεις.

Η μέθοδος που βασίζεται στην PCR χρησιμοποιείται επίσης σε ανθρώπους για τον έλεγχο πατρότητας, τη διάγνωση πολλών γενετικών ασθενειών (π.χ. νόσος του Huntington), τον εντοπισμό θυμάτων καταστροφών, την εξακρίβωση γενεαλογικών δένδρων, τον εντοπισμό αγνοουμένων και τη διερεύνηση ιστορικών προσωπικοτήτων (π.χ. τον τελευταίο τσάρο της Ρωσίας και της οικογένειάς του). Σε άλλους οργανισμούς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για σκοπούς διατήρησης (π.χ. να αναλύσει κατασχεμένο ελεφαντόδοντο), σε φαρμακευτικές έρευνες (π.χ. με ανάλυση κατασχεθέντων φυτών κάνναβης), για τον έλεγχο της τροφή ή της ποιότητας του νερού (π.χ. με εντοπισμό μολυσματικών μικροβίων), στην ιατρική (π.χ. για να ανιχνεύουν ιογενείς λοιμώξεις όπως HIV, ηπατίτιδα ή γρίπη) και σε έρευνες για βιοτρομοκρατία (π.χ. για τον προσδιορισμό μικροβιακών στελεχών).

Η γενετική αποτύπωση που στηρίζεται στα RFLP, αν και σε μεγάλο βαθμό ξεπερασμένη λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων της μεθόδου PCR (Πίνακας 1), εξακολουθεί να χρησιμοποιείται για την ταξινόμηση των φυτών και των ζώων στη βασική έρευνα. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν δεν υπάρχουν επαρκείς πληροφορίες σχετικά με το γονιδίωμα των ειδών – θυμηθείτε ότι για τη μέθοδο PCR, χρειαζόμαστε περιοχές που ποικίλουν ευρέως μεταξύ των ατόμων και πλευρίζονται από συντηρημένες περιοχές γνωστής αλληλουχίας.

Η γενετική αποτύπωση στο σχολείο

Η απομόνωση του DNA στο σχολείο δίνει στους μαθητές μια «ουάου» στιγμή όταν συνειδητοποιούν ότι βλέπουν την πλήρη γενετική πληροφορία που κωδικοποιεί έναν οργανισμό – μερικές ίνες σαν βαμβάκι από DNA που καθιζάνει στην αλκοόλη. Είναι εύκολο να εκτελεστεί στο σχολείο με τη χρήση σιέλουw6 (ή επιθηλιακά κύτταρα από εμπορικά διαθέσιμα κιτ), μπιζέλια (Madden, 2006), ντομάτες, κρεμμύδια^w7 ή θύμο μόσχου (αν και καλό είναι να ελέγξτε τους τοπικούς περιορισμούς σχετικά με τη χρήση θύμο μόσχου στο σχολείο)^w8.

Η ανάλυση PCR ενός ειδικού STR στο ανθρώπινο DNA, για παράδειγμα το D1S80 ή το TH01, μπορεί να γίνει στο σχολείο^w6, χρησιμοποιώντας διαθέσιμα κιτ^w9 που διατίθενται στο εμπόριο σε λογικές τιμές, αν είναι απαραίτητο. Αν το σχολείο σας δεν έχει πρόσβαση σε ένα θερμοκυκλωτή, η θερμοκυκλοποίηση μπορεί να διεξάγεται σε τρία λουτρά ύδατος, αν και είναι κουραστικό και πολύ πρακτικό.

Εάν δεν είναι διαθέσιμος αυτός ο εξοπλισμός, υπάρχουν κιτ που αμφότερα προσομοιώνουν και απλοποιούν την όλη διαδικασία της γενετικής αποτύπωσης^w10. Αυτά τα κιτ περιέχουν θραύσματα DNA που προσομοιώνουν την ενίσχυση διαφορετικών αλληλομόρφων ενός STR ή VNTR. (Στην πραγματικότητα, είναι θραύσματα περιορισμού DNA από πλασμίδιο ή το DNA του φάγου λάμδα.) Το DNA απαιτεί ηλεκτροφόρηση και μετέπειτα χρώση έτσι ώστε οι μαθητές να μπορούν να συγκρίνουν τις «ενισχυμένες» αλληλουχίες DNA από ένα δείγμα των αποδείξεων με εκείνες πολλών υπόπτων. Φυσικά, αυτό είναι πολύ διαφορετικό από την ανίχνευση ενισχυμένων STRs χρησιμοποιώντας ηλεκτροφορητική αυτόματη αλληλούχιση (και δεν αντιπροσωπεύει με ακρίβεια ακόμα και την οπτικοποίηση των VNTRs χρησιμοποιώντας στύπωμα Southern, καθώς το DNA χρωματίζεται απευθείας στο πήκτωμα), αλλά παρόλα αυτά δείχνει τις αρχές της αναλυτικής διαδικασίας. Όταν χρησιμοποιείτε αυτά τα κιτ προσομοίωσης, οι μαθητές θα πρέπει να γνωρίζουν ότι τα πειράματα δίνουν την εντύπωση πως οι διαφορές μεταξύ των ατόμων μπορούν να προσδιοριστούν εύκολα, πράγμα που δεν συμβαίνει.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τον Wolfgang Nellen για τις ιδέες του σχετικά με το άρθρο και για την άδεια του οι οδηγίες του Science Bridge  να διατεθούν δωρεάν.

Είναι επίσης ευγνώμονες στην Shelley Goodman για τις συμβουλές της σχετικά με τη χρήση της εμπορικών κιτ στο σχολείο.