Consegue localizar uma mutação cancerígena? Teach article

Traduzido por Artur Melo. Como se desenvolve o cancro, e como conseguem os geneticistas saber que uma célula é cancerosa? Esta actividade de ensino desenvolvida pela ‘Communication and Public Engagement team’ do’ Wellcome Trust Sanger Institute’, Reino Unido, responde a estas e outras…

Todos os cancros resultam de alterações na sequência do ADN em algumas das nossas células. Como o material genético, que se encontra no interior das células, está exposto a agentes mutagénicos, tais como as radiações UV, pode acumular erros durante a replicação. Ocasionalmente, uma destas mutações altera a função de um gene crítico, aumentando a capacidade de crescimento da célula na qual ocorreu, e na sua descendência; estas células dividir-se-ão mais rapidamente que as suas vizinhas.

Gradualmente, o ADN adquire mais mutações, o que pode danificar outros genes chave, originando células que se dividem de uma forma particularmente rápida e se tornam invasivas. O resultado é a formação de um tumor, a invasão dos tecidos circundantes e, eventualmente, metástases – o alastramento do cancro para outras partes do corpo.

Os genes que levam ao desenvolvimento de cancros, quando sofrem mutações, são conhecidos por ‘oncogenes’.

Os genes supressores de tumores (TSGs; Figura 1) codificam a informação para a produção de proteínas que normalmente retardam o crescimento celular, evitando a divisão desnecessária ou promovendo a apoptose (morte celular programada), se o ADN celular for danificado. Ambas as cópias de um TSG terão de ser desactivadas pela mutação antes deste controle do ciclo celular se perder. Se uma das cópias se mantiver funcional, ainda haverá um ‘travão’ no crescimento da célula.

Os proto-oncogenes (figura 2), pelo contrário, codificam proteínas que estimulam a divisão celular e a diferenciação (especialização). Quando estes genes adquirem mutações, que tornam as proteínas continuamente activas ou fazem com que a actividade do gene fique definitivamente desrregulada, transformam-se em oncogenes, promovendo o crescimento e divisão celulares descontrolados. Com os proto-oncogenes, a mutação numa das cópias do gene pode ser suficiente para levar ao aparecimento de cancro

Cada caso particular de cancro é resultado de um conjunto específico de mutações em proto-oncogenes e/ou TSGs. Apesar do número ainda não ser conhecido, supõe-se que são necessárias cinco ou mais mutações em oncogenes para que uma célula (e as suas descendentes) se tornem cancerosas.

O KRAS (que se pronuncia ‘kay-rass’) é um proto-oncogene que codifica a proteína KRAS, uma proteína sinalizadora intracelular envolvida na promoção do crescimento celular (para distinguir genes de proteínas, convencionou-se escrever o nome dos genes em itálico). A actividade seguinte permite aos alunos utilizar informação genómica real do ‘Cancer Genome Project’^w1, para investigar mutações frequentes no gene KRAS associadas com a oncogénese (aparecimento de cancros) e o aparecimento de cancros pancreáticos, colo-rectais, pulmonares e outros. Originalmente criada para usar em visitas de estudo ao ‘Sanger Institute’^w2, a actividade foi depois disponibilizada através do website ‘Yourgenome.org’^w3. Fez, recentemente, parte do primeiro curso de bioinformática para professores europeus organizado pelo ELLS^w4 no ‘European Bioinformatics Institute’^w5 em Hinxton, Reino Unido. A actividade completa estimula o debate sobre as causas do cancro, função das mutações genéticas, estrutura e função das proteínas.

A actividade KRAS

Duração prevista: 45-60 minutos (incluindo a apresentação e discussão)

Materiais

Todos os materiais necessários para executar a actividade podem ser descarregados gratuitamente no website ‘Yourgenome.org’ separadamente ou num único ficheiro zip^w6.

• Um conjunto de 11 fichas de trabalho (KRAS_student_wsheet.pdf) – uma ficha de trabalho por par ou grupo de alunos. Uma versão alternativa está disponível para impressoras a preto e branco ou para uso de alunos daltónicos. Para grandes grupos (20 alunos ou mais), use dois conjuntos de fichas de trabalho, o que permite a dupla cobertura do gene.

• Uma banda com a sequência do gene KRAS (KRAS_gene_banner.pdf) para toda a turma, e uma folha com o gene KRAS (KRAS_genesheet_yg.pdf; Figura 3) por grupo de alunos. A ficha com o gene (impressa em A3 ou A4) prepara-se rapidamente. A banda KRAS, impressa em várias folhas de papel que são depois coladas, permite que os resultados de toda a turma sejam apresentados em simultâneo.
• Uma roda de codões (KRAS_codon_wheel.pdfou outra tabela de codões de ADN no sentido 5’-3’) por grupo (Figuras 4 e 5)
• Uma ficha de resumo (KRAS_ data_sheet.pdf) por grupo
• Canetas

Para utilizar a banda, irá precisar também de setas grandes para identificar as mutações na sequência do gene, quadrados para marcar as áreas que já foram verificadas (KRAS_annotations.pdf), e fita adesiva reutilizável (p.ex. Blu Tack®) para fixar as setas e os quadrados à banda com a sequência do gene. Saiba mais sobre como usar este método nas ‘Notas do Professor’ disponíveis para download^w6.

Como complemento, pode achar útil ter à mão modelos de ADN, de péptidos e/ou proteínas, e utilizar as animações do ‘Wellcome Trust Sanger Institute’ (Cancer: Rogue cells and Role of cancer genes) no website da actividade KRAS^w6.

Introdução à actividade

Na primeira parte da actividade, os alunos identificam diferenças entre as sequências do gene KRAS em células saudáveis e em células tumorais na sua ficha de trabalho, e marcam-nas na banda KRAS ou ficha do gene.

As fichas de trabalho possuem partes de sequências de ADN do KRAS obtidas de células saudáveis e células cancerosas, representadas por gráficos de linhas coloridas – uma para cada região do gene. As quatro bases são representadas nestes gráficos por quatro cores diferentes. Cada pico colorido representa uma das bases do ADN:

Vermelho: T

Verde: A

Azul: C

Preto: G (normalmente estes picos são amarelos mas esta cor não se vê bem no papel)

Há um total de 11 fichas de trabalho, cada uma representando duas regiões diferentes do gene KRAS. As seis mutações existentes no gene KRAS estão nas fichas 1 a 6, por isso não se esqueça de baralhar as fichas antes de as distribuir aos alunos. Devem ser todas trabalhadas para garantir a cobertura completa do gene. É importante referir aos alunos que as mutações são (relativamente) raras, e, por isso, nem todos irão encontrar uma; este facto pode ser usado para explorar a importância dos dados nulos e da análise abrangente em estudos científicos.

Identificação das mutações

Com as fichas de trabalho, os alunos irão comparar uma secção da sequência de ADN de uma célula saudável e de uma célula tumoral do mesmo paciente. A maneira mais fácil de identificar a ocorrência de uma mutação é escrever a sequência de ADN por baixo dos picos coloridos (há uma chave de apoio na folha) e comparar as sequências registadas.

Se uma das letras for diferente (um pico mudou de cor), então estamos perante uma mutação na sequência. Na figura 7 (à direita), o A na sequência de ADN de uma célula saudável foi substituído por G na célula tumoral.

Se os alunos encontrarem um pico duplo na posição de uma base, esta situação deve ser registada com as duas bases alternativas nessa posição, uma por cima da outra. Na figura 8, a sequência saudável de ADN apresenta um G, enquanto a sequência tumoral tem um G e um C. Isto não é uma inserção: representa uma mutação heterozigótica em que apenas numa das cópias do gene o C substituiu o G. Neste caso a sequência tumoral substituiu o G por um C.

Todos os alunos devem indicar as regiões do gene que verificaram marcando as regiões relevantes na ficha do gene (ver figura 9, à esquerda).

Os alunos que encontrarem uma mutação devem especificar a base com um circulo na ficha do gene (ver figura 9) e registar em que codão ela ocorreu (neste exemplo, codão 12).

Devem, também, preencher o quadro que se encontra na base da ficha de trabalho, usando a roda de codões para traduzir a sequência de ADN para aminoácidos, como mostra o Quadro 1:

Após todas as mutações terem sido encontradas, registe-as na ficha de resumo (ver Quadro 2).

Discussão dos resultados

Os resultados atrás indicados correspondem todos a substituições de uma única base. Estas mutações, na região codificadora de proteína do gene KRAS, podem ser classificadas num de três tipos, de acordo com a informação codificada pelo codão alterado.

• Mutações silenciosas codificam o mesmo aminoácido.
• Mutações com perda de sentido codificam um aminoácido diferente.
• Mutações sem sentido codificam um stop e podem truncar a proteína.

Verifique se as mutações são expressivas – terão elas impacto na função da proteína ou serão elas ‘silenciosas’? Nesta actividade, os codões 30 e 173 são silenciosos e, portanto, não têm impacte funcional.

A apresentação tem uma imagem 3D, com espaços para prencher, da proteína KRAS (figura 10, à direita); os slides 26 a 30 mostram em que local da proteína se encontram as mutações expressivas, e poderá verificar que estão todas na mesma região. Os codões 12, 13 e 61 foram as primeiras mutações a ser associadas com a transformação oncogénica na proteína KRAS; a mutação 146 apenas foi descoberta em 2005. Utilize estes slides para discutir o impacte que as mutações poderiam ter na estrutura da proteína e na função da KRAS na sinalização do crescimento.

Como actividade opcional, os alunos podem utilizar o RasMol, um software de modelação de moléculas que foi usado para criar as imagens dos slides 26 a 30, para destacar os aminoácidos mutados na estrutura da proteína. Ver as notas do professor^w6 para mais detalhes.

Como influencia este tipo de informação a nossa abordagem ao cancro?

As notas do professor^w6 contêm uma vasta informação de base, usando o KRAS como exemplo, para estimular a discussão sobre como a informação genómica pode ser usada para facilitar o nosso conhecimento sobre o cancro e desenvolver tratamentos para o cancro. Tópicos de discusão para os alunos incluem:

• Que experiências ou abordagens poderiam ser usadas para estabelecer quais os cancros relacionados com as mutações KRAS?
• Quais poderiam ser as vantagens de conhecer esta informação?
• O cancro é uma doença genética: é o resultado de alterações na sequência do ADN. É por isso que muitas pessoas acreditam que a aplicação de fundos na investigação da genética oncológica é a melhor maneira de desenvolver novos tratamentos para o cancro e, por isso, lidar com a doença. O tratamento do cancro e o tratamento de doentes também precisa de grandes quantias monetárias (o ‘National Health Service’ do Reino Unido gastou mais de 2000 milhões de libras em tratamentos de cancro só em 2000). Onde e como acham os alunos que o dinheiro deve ser gasto?

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