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Desde drogas hasta cambio climático: experimentos prácticos con Daphnia como organismo modelo Teach article
¿Cómo afectan al metabolismo las drogas sociales? ¿Cómo se mide su toxicidad? ¿Cómo afecta el cambio climático a los ecosistemas acuáticos? Fomenta el aprendizaje activo al responder estas preguntas con Daphnia
Introducción
Daphnia, una especie de micro crustáceo de agua dulce, es un organismo modelo que tiene muchas ventajas practicas: es fácil de cultivar bajo condiciones de laboratorio, el tamaño de su cuerpo es pequeño (2-5 mm), su ciclo de vida es corto, es de fácil manejo, tiene alta fecundidad, presenta reproducción partenogenética, y sus costos de mantenimiento son bajos.[1,2] Debido a su exoesqueleto translucido y quitinoso, es posible observar los órganos internos de las Daphnia bajo un microscopio o bajo lentes binoculares de aumento.[3] Son animales muy sensibles y debido a que sus respuestas biológicas fundamentales son similares a las de los humanos, se utilizan como modelos para estudiar los efectos de varias drogas sociales, como el café, el tabaco y el alcohol, y también se usan para evaluar la calidad del agua.[2] Los ecosistemas de agua dulce se encuentran entre los más amenazados en el mundo, nos abastecen de agua potable y de irrigación, de alimentos, regulan el clima, evitan la erosión y son lugares de recreo para las sociedad. El cambio climático ha incrementado la concentración de sales en las aguas dulces, con efectos drásticos en la salud y la supervivencia de los organismos de agua dulce.
Imagen: Paul Hebert/Reference [4], CC BY 4.0
Las actividades prácticas que se describen en este artículo son adecuadas para estudiantes de 14-19 años y son una herramienta valiosa para evaluar los efectos de las drogas sociales en el sistema cardiovascular, y la influencia de la salinización en la supervivencia de las Daphnia. Al investigar estos efectos, los estudiantes aprenderán a recabar y a manejar datos experimentales para sacar sus propias conclusiones. A partir de sus conclusiones, los estudiantes podrán considerar repercusiones en la salud humana, y comprender los efectos del cambio climático en los ecosistemas de agua dulce.
Cómo cultivar Daphnia
Los cultivos se pueden guardar en recipientes con un máximo de 30 Daphnia por litro en agua libre de cloruro con un pH de 7-8, a una temperatura de 18–25°C, durante un fotoperiodo controlado de 16 h y se alimentan 2-3 veces por semana con microalgas o levadura (5 gotas/litro). Niveles bajos de oxígeno disuelto son letales.
Suspensión de levadura
Para preparar una suspensión de levadura (un hongo unicelular), agrega agua sin cloruro a un recipiente de 1 litro e incorpora 2 g de levadura para hornear. Almacena la suspensión en un frigorífico (4°C) y siempre agítala antes de usarla para que la levadura se vuelva a suspender. Agrega 5 gotas/litro de este alimento a los cultivos de Daphnia 2-3 veces por semana.
Cómo cultivar Microalgas
Las microalgas son organismos fotosintéticos microscópicos. Tienen un papel central en la vida sobre la tierra, ya que forman la base de la red alimenticia en muchos ecosistemas acuáticos. Scenedesmus es una microalga verde no móvil, típica en el fitoplancton de agua dulce, que es fácil de cultivar y mantener en el laboratorio y se usa de forma rutinaria para alimentar a las Daphnia.
Imagen cortesía de los autores
Los cultivos de Scenedesmus requieren el uso de agua libre de cloruro con un pH de 7-8, a una temperatura mínima de 16°C (18 a 25°C), y con un fotoperiodo mínimo de 12 h que provenga de una fuente de luz para acuario LED (o fluorescente). El cultivo de microalgas se debe mantener en un recipiente donde circule el aire (un biorreactor) para crear el CO2 necesario para la fotosíntesis y evitar la sedimentación de las microalgas en el fondo del recipiente. Cada 15 días, se debe suplementar el cultivo con una solución de sales minerales preparada con 3-5 gotas/litro de líquido fertilizante de plantas comercial.
Imagen cortesía de los autores
Actividad 1: Aumento y disminución del ritmo cardiaco
El consumo de drogas sociales causa cambios en el sistema nervioso central, lo cual resulta en cambios fisiológicos y/o del comportamiento. Las drogas estimulantes (cafeína, nicotina) se caracterizan por aumentar el metabolismo del cuerpo, mientras que drogas depresivas (alcohol) lo disminuyen. El ritmo cardiaco se puede monitorear como un indicador óptimo de estos cambios.
Observar cómo estas drogas afectan a un organismo vivo en tiempo real, permite a los estudiantes establecer una relación de los posibles efectos de las drogas en sus cuerpos. El cuerpo transparente de Daphnia permite que se midan diferentes parámetros fisiológicos por medio de métodos ópticos no invasivos. Un bioensayo es un procedimiento que utiliza organismos vivos para determinar los efectos de una sustancia química. La duración completa de esta actividad será alrededor de 2 h, pero se puede hacer en 1 h si las soluciones se preparan con anticipación.
Imagen cortesía de los autores
Materiales
- Agua de grifo sin cloro/clorada desde hace mucho tiempo
- Frasco que contenga Daphnia jóvenes y vivas (de menos de 48 h)
- Microscopio estéreo u óptico.
- Portaobjetos cóncavo
- Pipetas de plástico (3 ml) con las puntas cortadas
- Lana de algodón
- Papel filtro
- Vasos de precipitado
- Alcohol (6%, 12% y 20%)
- Café 30% (70 ml de agua destilada + 30 ml de café instantáneo)
- Tabaco
Imagen cortesía de los autores
Preparación de la solución de tabaco
- Pesa 2 g de tabaco, agrega el agua destilada y afora a un volumen de 100 ml, deja macerar (12 h), agita la solución al menos 4 veces.
- Filtra con el papel filtro. La solución de tabaco dura 2-3 días.
Procedimiento
En la hoja de trabajo que se proporciona (ver la tabla de muestra), los estudiantes pueden predecir los efectos de las drogas sociales en el ritmo cardiaco de las Daphnia. Antes de empezar el trabajo experimental, vean este video para aprender cómo localizar el corazón de las Daphnia y cómo contar sus latidos.
- Agrega 2 gotas de agua del medio de cultivo de las Daphnia (suficiente para sumergir al animal) en el portaobjetos cóncavo.
- Usa una pipeta (con la punta cortada) para colocar con precaución una Daphnia en el portaobjetos cóncavo.
- Coloca unas cuantas hebras de algodón en la depresión del portaobjetos (solo las suficientes para inmovilizar a la Daphnia).
- Con un microscopio estéreo u óptico, determina el ritmo cardiaco basal de cada Daphnia (control). Toma tres lecturas, cada una de 30 s.
- Quita el portaobjetos cóncavo del microscopio y agrega una gota de la solución que contiene la droga social (experimento).
- Después de un minuto, repite el paso 4 y determina el ritmo cardiaco. Toma tres lecturas, cada una de 30 s.
- Repite el procedimiento con las otras muestras con drogas sociales y utiliza una Daphnia nueva cada vez.
- Anota y discute los resultados.
- Realiza y presenta un afiche científico.
Notes
Precaución: si se usa demasiado algodón, podría ser difícil observar el corazón de las Daphnia.
| Predicción (según la tabla abajo) | Ritmo cardiaco control (lpm) | Ritmo cardiaco experimental (lpm) | |
| Tabaco | |||
| Alcohol (6%) | |||
| Alcohol (12%) | |||
| Alcohol (20%) | |||
| Café |
KeyClave:
| +++ | Incremento significativo en el ritmo cardiaco |
| ++ | Incremento en el ritmo cardiaco |
| + | Incremento no significativo en el ritmo cardiaco |
| 0 | Ningún cambio en el ritmo cardiaco |
| – | Disminución no significativa en el ritmo cardiaco |
| — | Disminución en el ritmo cardiaco |
| — | Disminución significativa en el ritmo cardiaco |
| x | heart stops |
Si el ritmo cardiaco control resulta ser menor que 200 latidos por minuto (lpm) o mayor que 300 lpm, la lectura se debe repetir.
Notas de seguridad
Se deben tomar precauciones para evitar que las soluciones experimentales entren en contacto con la piel, ojos o boca de los estudiantes.
Al final de la actividad, los estudiantes deberán lavarse las manos
Discusión
Los cuerpos transparentes de las Daphnia permiten observar visualmente sus órganos internos y medir sus características fisiológicas, como el ritmo cardiaco. Se pueden usar como un sistema modelo para experimentos de toxicología porque son muy sensibles a las perturbaciones ambientales y exhiben respuestas fisiológicas rápidas cuando se les expone a aguas contaminadas.[5]
Se ha demostrado que el uso de animales vivos en experimentos de investigación auténticos, aumenta nuestro entendimiento de conceptos científicos. Después del experimento, haz las siguientes preguntas a los estudiantes para ayudarles a comprender la influencia que las drogas sociales tienen en el sistema nervioso, cuando las Daphnia se usan como organismo modelo:
¿Cuál es el propósito de mantener algunas Daphnia en agua pura?
¿Por qué se usa un promedio de tres series de latidos del corazón?
¿Por qué se usa una Daphnia nueva con cada una de las soluciones experimentales (drogas sociales)?
¿Cuál es la ventaja/importancia de usar clones?
Compara las predicciones con los datos experimentales. Debate si Daphnia es un modelo biológico adecuado para estudiar diversos tipos de estresores.
Actividad 2: Cambio climático: ¿cómo afecta a las Daphnia la exposición a la sal?
La salinización en los ecosistemas de agua dulce es un problema en aumento causado por actividades humanas como la irrigación, la extracción de recursos, la erosión acelerada de las rocas debido a la lluvia ácida, el uso de fertilizantes en la agricultura, las sales en las carreteras, la minería y las construcciones urbanas. Este problema se exacerba aún más a causa del cambio climático, debido a la disminución de las lluvias, al aumento de la evaporación, y por la necesidad más frecuente de irrigar cultivos.[6,7] Las investigaciones de bioensayo pueden aumentar el entendimiento de los estudiantes acerca de los efectos de la salinización en la supervivencia de las Daphnia; por lo tanto, fomenta una conexión conceptual entre la supervivencia de organismos simples y los efectos que tiene en los ecosistemas de agua dulce. Estos organismos necesitan mantener un equilibrio osmótico entre la concentración iónica dentro de sus células y sus fluidos corporales. La salinidad del agua que les rodea tiene una gran influencia en este proceso.
En esta actividad, los estudiantes determinarán la toxicidad del NaCl en las Daphnia al calcular el valor de LC50 (concentración letal, 50%), el cual se define como el nivel de concentración de la toxina que mata al 50% de los organismos expuestos. Este experimento debe durar alrededor de 20 min.[1]
Materiales
- Agua del grifo sin cloro/clorada desde hace mucho tiempo
- Frasco que contenga Daphnia jóvenes (de menos de 48 h de edad)
- Soluciones de NaCl (0,5%, 1%, 1,5%y 2%)
- Probeta graduada ( 10 ml)
- 5 vasos de precipitado pequeños o vasos para mezclar las soluciones
- 5 tubos de ensayo de al menos 10 ml (o cámaras de exposición y rejillas para tubos de ensayo o vasos pequeños)
Procedimiento
- Prepara las soluciones con las diferentes concentraciones de sal (0,5%, 1%, 1,5% y 2% NaCl).
- Etiqueta cinco tubos de ensayo y vierte el agua clorada desde hace mucho tiempo, o una de las soluciones de sal (10 ml).
- Usa una pipeta (con la punta recortada) para colocar con cuidado 10 Daphnia en cada tubo de ensayo.
- Después de 5 min, 10 min y 20 min, observa el comportamiento de las Daphnia vivas y cuenta el número de Daphnia que han muerto (las que estén inmóviles).
- Anota los resultados en una tabla.
- Grafica los datos de la mortalidad de las Daphnia (el porcentaje que murió después de 20 min) versus la concentración de la solución de sal.
- Determina el valor de LC50 de sal para Daphnia.
- Realiza y presenta un póster científico.
Nota
En la muestra control, la mortalidad no debe superar el 10%.
| NaCl (%) | Número de Daphnia que murió después de | % de mortalidad (después de 20 min) | Observaciones en el comportamiento de las Daphnia | ||
| 5 min | 10 min | 20 min | |||
| 0 | |||||
| 0.5 | |||||
| 1 | |||||
| 1.5 | |||||
| 2 | |||||
Nota
No usar detergente para limpiar el material de vidrio. Los residuos de detergente pueden ser tóxicos para las Daphnia.
Discusión
Después de hacer el experimento, discutan los resultados para entender mejor la influencia del cambio climático en el comportamiento y supervivencia de las Daphnia y de otros organismos acuáticos.[8,9] Las preguntas pueden ser las siguientes:
- ¿Cuál es el propósito de mantener algunas Daphnia solamente en agua?
- Calcula el LC50 del cloruro de sodio para las Daphnia.
- ¿Qué opinas sobre el efecto a largo plazo que la salinización puede tener en las poblaciones de Daphnia?
- ¿De qué manera puede afectar el cambio climático a los ecosistemas de agua dulce?
¿Se te ocurre alguna repercusión que esta investigación pueda tener en la población humana?
Esta actividad podría ser también la base de una discusión acerca de las cuestiones éticas del uso de animales vivos para la investigación. El uso de organismos simples como las Daphnia es poco controversial, relativamente. Pero ¿dónde pondrían un límite los estudiantes? En este artículo se puede encontrar más información acerca del por qué puede ser importante el uso de animales en la investigación y cómo podemos minimizar su uso.
References
[1] Cahill K (2006) Bioassay investigations with Daphnia. My Environment, My Health, My Choices. University of Rochester.
[2] OECD (2004) Test No. 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. OECD Publishing, Paris. doi: doi.org/10.1787/9789264069947-en
[3] Tkaczyk A et al. (2021) Daphnia magna model in the toxicity assessment of pharmaceuticals: a review. Science of the Total Environment 763: 143038. doi: 10.1016/j.scitotenv.2020.143038
[4] Gewin V (2005) Functional Genomics Thickens the Biological Plot. PLOS Biology 3: e219. doi:10.1371/journal.pbio.0030219
[5] Gleichsner AM, Butler SR, Searle CL (2019) Dynamic Daphnia: an inquiry-based research experience in ecology that teaches the scientific process to first-year biologists. CourseSource. doi: 10.24918/cs.2019.2
[6] Kaushal SS et al. (2021) Freshwater salinization syndrome: from emerging global problem to managing risks. Biogeochemistry 154: 255–292. doi: 10.1007/s10533-021-00784-w
[7] Jeppesen E et al. (2020) Salinization increase due to climate change will have substantial negative effects on inland waters: a call for multifaceted research at the local and global scale. The Innovation 1: 100030. doi: 10.1016/j.xinn.2020.100030
[8] Martinez D et al. (2022) Daphnia magna and mixture toxicity with nanomaterials – current status and perspectives in data-driven risk prediction. nanotoday 43: 101430. doi: 10.1016/j.nantod.2022.101430
[9] Müller M et al. (2018) Temperature-driven response reversibility and short-term quasi-acclimation of Daphnia magna. PLOS ONE 13: e0209705. doi: 10.1371/journal.pone.0209705
Resources
- Un sitio web informativo que detalla el efecto del cambio climático en los ecosistemas de agua dulce.
- Haz algunos experimentos interesantes con bioluminiscencia que integran biología, química e ingeniería: Wegner C, Hammann M, Zehne C (2021) Bioluminiscencia: combinando la biología, la química y la biónica Science in School 53.
- Explora acerca de la resistencia a los antibióticos y el desarrollo de fármacos con estas divertidas actividades en microbiología: Deumal Fernandez M, Lladonosa Soler M, Godinho T (2021) Microbiology: Discovering antibacterial agents. Science in School 55.
- Aprende sobre la importancia del uso de animales en la investigación y algunos enfoques nuevos para minimizar su uso: Schmerbeck S et al. (2021) Los sistemas de organ-on-chip y las 3Rs. Science in School 54.
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