Microbiologia: alla scoperta degli agenti antibatterici Teach article

Author(s): Mireia Deumal Fernandez, Mariona Lladonosa Soler, Tamaryin Godinho
Translator(s): Piero Lo Monaco

Cosa possiamo fare riguardo alla crisi della resistenza antimicrobica? Cosa serve per sviluppare un nuovo farmaco? Possiamo combattere i batteri con sostanze comuni o addirittura con l’alimentazione? Scoprilo con queste entusiasmanti attività di microbiologia.

Introduzione

Nonostante non si vedano a occhio nudo, i batteri sono gli organismi più abbondanti sul pianeta. La maggior parte di questi organismi sono innocui per gli esseri umani, se non addirittura benefici, come i batteri della flora intestinale,[1] mentre alcuni sono causa di malattie. Fin dalla scoperta della penicillina, siamo stati capaci di trattare le infezioni batteriche con gli antibiotici. Tuttavia, la resistenza agli antibiotici è diventata oggi comune e assistiamo ancora una volta all’emergere di infezioni batteriche potenzialmente letali.[2,3] Secondo un recente rapporto dell’Agenzia Europea dei Farmaci (EMA), le infezioni da batteri multi-resistenti causerebbero in UE 33 000 morti all’anno, con un costo annuo di 1.5 miliardi per le spese mediche e la perdita di produttività associata.[4] In effetti, l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha dichiarato che “La resistenza agli antibiotici è oggi una delle maggiori minacce alla salute globale, alla sicurezza alimentare e allo sviluppo.”

Immagine: Billion Photos/Shutterstock.com

Queste attività permettono di esplorare questo grave problema a livello pratico. La prima attività presenta alcuni principi e tecniche di base, mentre nel secondo è possibile condurre la propria ricerca formulando ipotesi su potenziali composti antimicrobici e sottoponendole a prova sperimentale. Le schede annesse forniscono informazioni di carattere generale e discussioni guidate.

Safety note

Oltre a seguire le normali precauzioni di laboratorio e di biosicurezza:

Non incubare colture alla temperatura corporea umana – questo abbassa il rischio di selezionare batteri patogeni.[5]

Smaltire adeguatamente gli antibiotici inutilizzati e le colture batteriche per evitare di rilasciare antibiotici o batteri resistenti nell’ambiente.

Dopo l’incubazione, fissa i coperchi alle piastre con del nastro adesivo per evitare che si aprano per sbaglio. Non usare il nastro prima dell’incubazione, per evitare di promuovere la crescita di organismi anaerobici.

Attività 1: Antibiotici e resistenza

L’obiettivo di questa attività è mostrare l’azione degli antibiotici e le relazioni dose-effetto e spiegare il rischio legato alla resistenza agli antibiotici. L’attività è da realizzarsi solo se gli antibiotici e le piastre di coltura possono essere smaltite adeguatamente. In caso contrario, si usi la Scheda 1 prima di passare all’Attività 2. L’attività è adatta a studenti tra 14 e 19 anni e consiste di due lezioni (una per avviare le colture batteriche; una per analizzare e discutere i risultati).

Occorrente

  • Piastre Petri con mezzo di coltura a base di agar
  • Disinfettante, per esempio etanolo al 70%
  • Colture batteriche (se possibile almeno una Gram-positiva e una Gram-negativa per studente)
  • Ansa per spatolamento o da inoculo
  • Compresse di antibiotici
  • Carta spessa e punzonatrice per carta
  • Pinzette
  • Cilindro graduato, becker/beute, pipetta per preparare soluzioni seriali
  • Soluzione salina fisiologica (0,9% NaCl) o acqua
  • Schede 1 e 2 e risorse sulla resistenza agli antibiotici, come quelle fornite dalla US Food and Drug Administration (FDA) e dall’OMS.[6,7]

Procedimento

Lezione 1

  1. Sterilizzare il bancone da laboratorio o il piano di lavoro spruzzandolo di etanolo e passando la carta. Disinfettare le mani con soluzione idroalcolica per almeno 20 secondi.
  2. Usando un’ ansa, toccare la coltura batterica e distribuirla sulla piastra. È consigliabile che questo passaggio sia prima mostrato dall’insegnante o dall’assistente tecnico. Vedere alla sezione specifica per protocolli dettagliati.
  3. Indicare sul fondo della piastra il nome del gruppo e dell’antibiotico scelto. Scrivere sempre sul fondo: il coperchio potrebbe essere confuso con un altro.
  4. Ritagliare diversi dischetti di carta spessa con la punzonatrice e segnarli con una matita (indicando il controllo e le varie diluizioni di antibiotico).
  5. Dissolvere 300 mg di una pastiglia di antibiotico in 200 ml di soluzione salina o acqua. Si raccomanda di sbriciolare le pastiglie solide con un pestello e un mortaio; le capsule di gel possono essere aperte delicatamente per versarne il contenuto.
  6. Preparare diluzioni seriali 1 a 5 fino a ottenere la gamma seguente: 1/1, 1/5, 1/25, 1/125 e 1/625.
  7. Bagnare i dischetti di carta con le soluzioni. Usare le pinzette per posizionare i dischetti sulle piastre piastrate coi batteri.
Per gentile concessione degli autori
  1. Incubare a una temperatura costante per 24 ore o finché le colonie batteriche sono visibili. Se necessario, una persona può controllare e conservare le piastre nel frigo del laboratorio fino alla lezione successiva. Conservare le piastre rivolte verso il basso per evitare che la condensa goccioli sui batteri.
  2. Distribuire la Scheda 1 e le risorse sulla resistenza agli antibiotici, da discutere a questo punto o alla fine della lezione 2.

Lezione 2

  1. Fotografare le piastre e misurare con un righello il diametro della zona di inibizione (senza aprire la piastra).
Una piastra di verifica di un antibiotico con chiari cerchi chiari privi della crescita batterica di Staphylococcus aureus, che invece cresce intorno ai dischetti imbevuti di antibiotico
Immagine: Don Stalons/CDC, Dominio Pubblico

  1. Da una ricerca sull’antibiotico utilizzato sulla piastra, si può indovinare il gruppo di batteri (Gram-positivi o negativi). Eventualmente, questo si può in seguito verificare con una colorazione di Gram.
  2. Compilare la Scheda 2.

Discussione

Questo passaggio può sia venire dopo la preparazione delle piastre sia subito prima della loro analisi. Seguire la scheda fornita per analizzare i risultati e discutere i rischi legati alla resistenza agli antibiotici. Le questioni da discutere includono:

  • Oltre alla resistenza, quali altre conseguenze ha prendere antibiotici quando non è necessario?
  • In molti paesi, per questi motivi le farmacie non sono autorizzate a vendere antibiotici senza la prescrizione di un medico. Nel tuo paese? Sei d’accordo?
  • L’uso di antibiotici in questa stessa attività non potrebbe favorire la resistenza agli antibiotici? Se sì, come prevenire il problema?

Attività 2: Testare l’attività antibiotica di una sostanza

Una volta compresa la necessità di sviluppare nuovi antibiotici, la classe avrà ora la possibilità di valutare l’azione antibiotica di una sostanza, discutendo poi dei principi di base dello sviluppo dei farmaci e della differenza tra generiche sostanze che mostrano attività e veri e propri farmaci. Si imparerà a formulare ipotesi, pianificare un esperimento per sottoporle a verifica, analizzare i risultati. La classe si sentirà particolarmente coinvolta se sarà data la possibilità di proporre sostanze da testare.

L’attività è adatta a studenti tra 14 e 19 anni e consiste di tre lezioni.

Occorrente

  • Piastre Petri con colture già avviate, preparate come nell’Attività 1
  • Colture batteriche (per es. Bacillus cereus)
  • Sostanze di cui testare l’attività antibiotica
  • Strumenti per la preparazione (per es. tagliere, pestello…)
  • Carta spessa e punzonatrice per carta
  • Pinzette
  • Soluzione salina fisiologica (0,9% NaCl)
  • Soluzione disinfettante (per es. etanolo al 70%)

Procedimento

Lezione 1

  1. Se non è stata condotta l’Attività 1, innanzitutto discutere la questione della resistenza agli antibiotici e la necessità di nuovi antibiotici. La Scheda 1 si può usare a tale scopo.
  2. Chiedere alla classe di quale sostanza di uso comune si vorrebbe testare l’attività antibiotica. Alcune idee potrebbero già essere proposte come antibiotici: prodotti per pulire, cosmetici (come il colluttorio), cibi.
  3. Stilare una lista di sostanze da testare. Escludere quelle molto tossiche o corrosive come veleno per ratti o prodotti per il bagno. Proposte valide sono sale, colluttorio (con o senza alcol), sapone antibatterico, sapone naturale (alcuni batteri se ne nutrono!), vari alimenti come aglio, miele (da confrontare a una soluzione di zucchero?), cavolo, spezie come curcuma o chiodi di garofano, vari oli essenziali, succo di limone, succo di mela.
Per gentile concessione degli autori
  1. Invitare la classe a fare ipotesi sull’attività batterica di ciascuna sostanza. Possono prima condurre una ricerca o semplicemente indovinare sulla base della saggezza popolare o di un loro ragionamento. Questa è una buona opportunità per discutere dell’affidabilità delle fonti e non credere in qualunque cosa si trovi su internet, inclusi certi “studi scientifici”. Non tutte le riviste scientifiche vegliano alla qualità allo stesso modo! Alcuni riferimenti per le attività antibiotiche degli alimenti sono questi articoli sulle spezie e sul miele.[8,9]
  2. Invitare la classe a compilare la Tabella 1 della Scheda 3. Se non si conosce la risposta, si può provare a indovinare o cercarla oppure saltare.
  3. Decidere se usare le sostanze pure o diluite. Magari provare entrambe?
  4. Chiedere alla classe di portare varie sostanze alla prossima lezione; in alternativa può portarle l’insegnante.

Lezione 2

  1. Sterilizzare il bancone da laboratorio con uno spruzzino ad etanolo e passando la carta. Disinfettare anche le mani con un gel idroalcolico per almeno 20 secondi.
  2. Usando una ansa, piastrare i batteri sulla piastra. È consigliabile che questo passaggio sia prima mostrato dall’insegnante o dall’assistente tecnico. Vedere alla sezione specifica per protocolli dettagliati.
  3. Con un pennarello, indicare sul fondo di ciascuna piastra il nome del gruppo e della sostanza scelta. Dopodiché, ritagliare quattro dischetti di carta spessa per ogni piastra e segnarli con una matita.
Dischetti di carta. Qui sono segnati a penna, ma a matita è meglio a causa dell’eventuale presenza di solventi.
Per gentile concessione degli autori
  1. Prepara le sostanze alla dose stabilita e metterle da parte. Vedere nota più avanti.
  2. Bagnare ciascun dischetto di carta con la soluzione corrispondente, o la soluzione salina come controllo. Posizionarli sulla superficie della piastra.
  3. Incubare a una temperatura costante per 24 ore o finché le colonie batteriche sono visibili. Se necessario, una persona può controllare e conservare le piastre nel frigo del laboratorio fino alla lezione successiva. Conservare le piastre rivolte verso il basso per evitare che la condensa goccioli sui batteri.

Nota sulla preparazione delle sostanze

  • Si può provare a dividere le sostanze da testare tra quelle a base oleosa o a base acquosa. La componente attiva dei solidi, come le spezie in polvere, può essere solubile in olio o acqua. In questo caso, dissolvere le sostanze idrosolubili in una soluzione salina e quelle liposolubili in un olio neutro (per es. l’olio di semi di girasole, che fungerà anche da controllo per queste sostanze).
  • I vegetali dovrebbero essere spremuti per trarne il succo. Cibi più duri come il cavolo possono essere grattugiati prima. Fare attenzione se si usano lame o grattugie.
  • Per gli agrumi, si possono testare sia il succo che l’olio presente nella scorza. Le strisce di scorza possono essere asportate e piegate (indossando opportune protezioni per gli occhi) per ottenerne l’olio.

Lezione 3

  1. Fotografare le piastre e misurare il diametro della zona di inibizione.
Sulle piastre di coltura, si formano zone vuote, prive di crescita batterica, intorno ai dischetti contenenti curcuma, succo di limone e colluttorio.
Esempi di piastre testate con miele, curcuma, succo di limone, colluttorio senza alcol (in senso orario)
Per gentile concessione degli autori
  1. Invitare la classe a compilare la Scheda 3 con i risultati.
  2. Lavorare sulle questioni da dibattere nella Scheda 3.

Discussione

La discussione sulla scheda è concepita per spiegare lo sviluppo di un farmaco e la grande differenza tra una sostanza dotata di attività e una utile come farmaco. Gli stessi principi si applicano alle sostanze con attività antitumorale. Questa conoscenza dovrebbe facilitare la valutazione critica degli scoop giornalistici sulle proprietà miracolose di varie sostanze contro le malattie.

References

[1] Stark LA (2010) Beneficial microorganisms: countering microbephobia. CBE Life Sciences Education 9: 387–389. doi: 10.1187/cbe.10-09-0119.

[2] Chokshi A et al. (2019) Global contributors to antibiotic resistance. Journal of Global Infectious Diseases 11: 36–42. doi: 10.4103/jgid.jgid_110_18.

[3] Aslam B et al. (2018) Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis. Infection and Drug Resistance 11: 1645–1658. doi: 10.2147/IDR.S173867.

[4] Informazione sulla resistenza agli antibiotici, stilata dall’EMA: https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/overview/public-health-threats/antimicrobial-resistance

[5] Informazioni di sicurezza del CLEAPSS su come maneggiare microrganismi: http://science.cleapss.org.uk/resource/SSS001-Microorganisms.pdf

[6] Risorse dell’FDA sulla lotta alla resistenza agli antibiotici: https://www.fda.gov/consumers/consumer-updates/combating-antibiotic-resistance

[7] Un documento dell’OMS sulla crisi della resistenza agli antibiotici: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance

[8] Liu Q et al. (2017) Antibacterial and Antifungal Activities of Spices. International Journal of Molecular Sciences 18: 1283. doi: 10.3390%2Fijms18061283

[9] Nolan VC, Harrison J, Cox JAG (2019) Dissecting the Antimicrobial Composition of Honey. Antibiotics 8: 251. doi:10.3390/antibiotics8040251

Resources

Procedimenti sperimentali

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  • Leggi articoli sullo sviluppo di farmaci al giorno d’oggi:

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– Houlton S (2019) The changing technologies of drug design. Science in School 46: 25–28.

Classroom resources

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Author(s)

Mireia Deumal Fernández è una ricercatrice biomedica all’Università di Barcellona, Spagna. Al momento segue un master sugli studi clinici e la regolamentazione medica.

Mariona Lladonosa Soler è biochimica e studia per un master in ricerca, sviluppo e controllo sui farmaci all’Università di Barcellona, Spagna.

Tamaryin Godinho è la redattrice esecutiva di Science in School. Ha un dottorato in medicina molecolare e un master in ricerca sullo sviluppo di antibiotici.

Questo articolo è stato ispirato dalla ricerca di Mireia e Mariona , che hanno sviluppato e presentato attività sugli antibiotici alla conferenza Hands-On Science a Kharkiv , in Ucraina, nel 2019.

 

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