Genetik parmak izi: bir göz atış Understand article

Çeviri: Selin Pekel, Canbolat Gürses, Hikmet Geçkil (Department of Molecular Biology and Genetics, Inonu University). Televizyondaki popular dedektif dizilerinde, suçluları belirlemede genetik parmak izi yaygın olarak kullanılır. Sara Müller ve Heike Göllner-Heibült sahne gerisine bir…

İnsanları kendi genetik özelliklerine göre ayırma fikri yeni değil. 1900 yılında Karl Landsteiner^w1 tarafından keşfedilen ABO kan grupları, adli tıpta ilk genetik belirleyici olarak kullanıldıktan sonra, Rhesus faktörü (1937) ve MN Kan grupları (1927) ile bu belirteçler tamamlandı.

Ancak eş zamanlı olarak üç kan grubunu analiz ettiğimiz zaman bile, yaklaşık olarak on kişiden biri aynı sonuçları verir ki bu durum kan naklini mümkün kılmaktadır. Fakat adli amaçlar için kullanılacaksa bu bir dejavantajdır. Çünkü sonuçlar kan örneğinizin şüpheli X’ten gelmediğini söyleyebilir, fakat size kan örneğinin şüpheli Y’den geldiğini de kabul edilebilir kesinlikte söylemez.

1970’ler ve 80’lerde kırmızı kan hücreleri ve kan serumunda farklı formlarda olan enzimler (izoenzimler)’in analizi ile ilerlemeler kaydedildi. Gerçekten şüpheliden gelen örneğin kesinliği analizi yapılacak protein sayısına (genellikle dört) bağlıydı. Biz bu kesinliğe ayrım gücü diyoruz. Bu birleşik tekniklerle sunulan ayrımın gücü 1:1000 idi. Bu oran 1:10 olan kan grubu analiz gücünden daha iyi olmakla birlikte hala yeterince iyi değildi. Daha iyi ayrım için, genetik bileşimimize daha yakından bakmamız gerekiyordu.

Genetik bileşimimiz – biz kimiz

İnsan genomu 46 çift kromozomdan oluşur ve bunların 23’ü anneden, 23’ü babadan gelir. Bu yüzden her kromozomdan iki taneye (erkeklerdeki cinsiyet kromozomları hariç) ve böylece her genin iki kopyasına sahibiz.

Kromozomların temel bileşeni deoksiribonükleik asittir (DNA) olup, yaşam için ihtiyacımız olan proteinleri yapan bilgiyi içerir. Halbuki 3 milyar baz çiftimizin (bp) sadece yaklaşık %4’ü gerçekten proteinleri kodlamaktadır; geri kalan kısım ise kümelerde düzenlenmiş tekrar eden dizilerden oluşan ‘dolgulardır’. İki insanın DNA’sı karşılaştırılırsa çoğu benzer olmakla beraber bu tekrarlayan dizilerde geniş ölçüde bir çeşitlilik bulunur.

Farklı insanlar tekrarlayan bu dizilerin farklı sayılarına sahip olabilir. Bir insan spesifik bir DNA lokusunda (bölge) beş tekrara sahipken bir başka insan yedi tekrara sahip olabilir. Örneğin kandan ya da meniden alınan örnekleri kullanırken, birkaç DNA bölgesindeki tekrarlayan dizileri analiz edebiliriz. Bu analizi genetik parmak izi olarak adlandırırız. Parmak izleri gibi, genetik parmak izi bireyleri ayırmada kullanılabilir.

‘Genetik parmak izi’ (veya genetik profilleme) terimi yaygın olarak kullanılmasına rağmen, herkes bunun gerçekte iki çok farklı tekniği kapsadığının farkında değil (günümüzde sadece bir tanesi adli tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır).

Erken genetik parmak izi: restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi

Genetik parmak izinde ilk method 1984’te Alec Jeffreys^w2 tarafından keşfedildi. Jeffreys çeşitli sayıda art arda dizilmiş tekrarlayan DNA dizilerini kullandı (VNTR’ler; örneğin dizi D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)_n). Tekrar başına 10-100 bp olan bu diziler, moleküler makas gibi çalışarak DNA’yı belirli bölgelerden (tanınma dizileri) kesen restriksiyon enzimleri kullanılarak incelenebilir. 6 bp’lik bir tanınma dizisi tüm genomumuzda yaklaşık 730 000 kez bulunacaktır.

Bunun anlamı, genomu bu tanıma dizisini tanıyan bir restriksiyon enzimiyle keserseniz çeşitli uzunluklarda yaklaşık 730 000 restriksiyon parçası elde edeceksiniz demektir. Bu, VNTR’lerin önemini ortaya koyae; belirli bir VNTR kümesinde tekrar sayıları bireyden bireye farklı olacağından, bireyler arsındaki restriksiyon parçası uzunlu da farklı olacaktır (Şekil 1). Bu olayı restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP) olarak adlandırmaktayız.
 

730 000 restriksiyon parçasından, yalnızca bazıları bireyler arasında farklılık gösterecektir ki bu durum gözle tespit edilemeyecek kadar küçüktür. Bunun yerine, bilim adamları, yalnızca ilgilenilen dizilerin görüntülenmesine izin veren Southern blotlama adlı bir tekniği kullandılar. Bunu yapmak için, bir elektrik akımı kullanarak yüklü DNA moleküllerini jelin içinden çeken jel elektroforezi yöntemi ile restriksiyon parçalarını boyutlarına göre ayırdılar. Katedilen mesafe parçanın büyüklüğüne bağlıdır (Şekil 2, Aşama 1). Daha sonra, DNA bir membrana transfer edildi (Şekil 2, Aşama 2) ve ilgilenilen VNTR(ler)’e komplementer radyoaktif bir prob (belirleyici etiket) uygulandı. Diziyle eşleşen (Şekil 2, Aşama 3) hibridize (birleşmiş) probun ve bir X-ray filmi üzerine membranın yerleştirilmesiyle bilimadamları radyoaktif olarak etiketli her biri farklı uzunluktaki bir parçayı temsil eden bantlara sahip bir resim elde ettiler (Şekil 2, Aşama 4). Bu resim genetik parmak iziydi.

Peki, bireyler arasında güvenli bir ayrım yaparken kaç tane VNTR’in karşılaştırılması gerekmektedir? Bilimadamları yeterli varyasyona sahip VNTR’leri seçerlerse (örneğin: 15’den 41’e kadar herhangi bir tekrara sahip olabilen D1S80 gibi) milyonda 1 ayırma gücüne sahip olmak için sadece dört farklı VNTR’ye gerek duyarlar. Bu oran, ABO kan gruplarının sunduğu onda birlik orandan çok daha iyidir.
 

Mevcut teknik: PCR-tabanlı genetik parmak izi

1983 yılında polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) Kary Mullis tarafından keşfi ona Kimya Nobel Ödülü^{w3, w4} kazandırmıştır. Bu icatla birlikte 1980’lerin sonunda kısa art arda tekrarların (STR’ler) (mikrosatellit olarak adlandırılan 2-9 bp tekrarlı diziler) keşfi günümüzde adli tıpta bilimadamlarının kullandığı yüksek hızlı genetik parmak izi tekniğine yol açtı.

PCR, ilgilenilen bir DNA lokusunun (örneğin; 4 baz çiftlik bir STR olarak bilinen D18S51, (AGAA)_n) tek bir DNA molekülünden bir milyar kopyasını birkaç saat içinde meydana getirerek geometrik olarak çoğaltılmasını sağlar (Şekil 3). Bu, adli tıptaki bilimadamlarına çok küçük örneklerin  (örn.,30 hücre kadar) bile analizini yapma avantajı sağladı (RFLP’ye dayanan genetik parmakiziyle bir karşılaştırma için Tablo 1’ e bakınız).

PCR analizi için tüm insanlarda özdeş diziler tarafından çevrilmiş olan STR’lere ihtiyaç duyarız (bu dizilerin korunduğunu söyleyebiliriz). Daha sonra korunmuş dizilere komplementer kısa moleküller olan primerler kullanarak PCR’ı başlatırız (Şekil 4’teki 1134 ve 1135 genleri). DNA çoğaltılınca, jel elektroforezi (Şekil 5) ya da modern adli bilimde kullanılan elektroforetik otomatik dizilime ile (Şekil 6), onu ayırabilir ve bir genetik parmak izi olarak görselleştirebiliriz.
 

Her bir kromozomun iki kopyasına sahibiz, bu yüzden her bir STR’nin iki kopyasına da sahibiz. Eğer bir kimse STR’nin her kopyası için aynı sayıda tekrarlara sahipse (yani aynı allel), PCR analizi sadece bir DNA parçasını (fragman) gösterecktir: kişi bu STR alleli için homozigottur (Şekil 5’teki yeşil ok Şekil 4’teki ikinci bireye karşılık gelmektedir). Eğer iki kromozom STR için aynı olmayan alleller taşıyorlarsa, iki farklı büyüklükte DNA parçaları (fragman) görürüz ve kişinin heterozigot olduğunu söyleriz (Şekil 5’teki kırmızı ok şekil 4’teki birinci bireye karşılık gelmektedir).

Sadece tek bir STR’yi analiz edersek, birbiriyle alakasız iki insanın aynı PCR’a dayanan genetik parmak izine sahip olma şansı yüksektir (1:2 ile 1:100 oranında) (Şekil 5’teki mavi oklar). Bunun nedeni STR’lerin daha az allellere ve RFLP’ye dayanan genetik parmak izinde kullanılan VNTR’lerden daha düşük heterozigositeye sahip olmasıdır. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için aynı anda birçok STR analizi yaparız. Örneğin, Almanya’daki adli sosyal çalışmalarda 16 STR bölgesinin analiz edilmesi yaygındır. Böylece, 1:10 milyar ayrım gücü elde edebiliriz (dünya nüfusundaki bir bireye eşittir; Şekil 6).
 

Genetik parmak izi uygulamaları

Şimdi genetik parmak izinin ne olduğunu biliyoruz fakat nasıl kullanıldığını biliyor muyuz? PCR tabanlı genetik parmak izi adli soruşturmalarda yaygın olarak uygulanmaktadır: saç kökü, deri, sperm, tükürük veya kan gibi genetik materyallere dayanarak polisin şüphelileri belirlemesine ya da dışarda tutmasına imkan vermektedir (aşağıdan indirilebilir hikayeyi görebilirsiniz ^w5). Ancak bir genetik parmak izi tek başına mahkumiyet için yeterli bir kanıt değildir çünkü yakın akrabalar çok benzer genetik parmak izlerine sahip olabilirler (ve tek yumurta ikizleri normalde aynısına sahiptir).

Avrupa’nın 16 STR analiz edilmesi yönündeki önerisine rağmen, her ülke hangi STR’ları analiz edeceğine kendisi karar vermekte, bu da uluslararası adli soruşturmaların karşılaştırılmasını zorlaştırmaktadır.

PCR tabanlı metot ayrıca insanlar için babalık testinde, birçok genetik hastalığın teşhisinde (örneğin; Huntingdon hastalığı), doğal felaketlerde hayatını kaybedenlerin belirlenmesinde, soy ağaçları takibinde, kayıp insanların bulunmasında, tarihi şahsiyetlerin incelenmesinde kullanılmaktadır (örneğin; Rusya’nın son çarı ve ailesi). Diğer organizmalarda, koruma amaçlı olarak (örneğin; analiz için fildişlerinin toplanması), ilaç soruşturmalarında (örneğin; ele geçirilen kenevir bitkilerinin analizi), su ve yemek kalitesinin kontrolünde (örneğin; kontamine edici mikropların belirlenmesinde), tıpta (örneğin; HIV, hepatit veya grip gibi viral enfeksiyonların tespitinde) ve biyoterörizmde (örneğin; mikrobiyal türlerin belirlenmesinde) de kullanılabilir.

Her ne kadar PCR yönteminin pek çok avantajından dolayı (Tablo 1), RFLP tabanlı genetik parmak izi büyük ölçüde önemini yitirmiş gibi görünse de bu metot temel araştırmalarda hayvanları ve bitkileri sınıflandırmak için hala kullanılmaktadır. Türlerin genomu hakkında yetersiz bilgi olduğu zaman RFLP tabanlı genetik parmak izi özellikle yararlıdır (PCR metodu için bilinen bir dizinin korunmuş bölgeleri ile çevrili ve bireyler arasında yaygın olarak değişiklik gösteren bölgelere ihtiyaç duyulduğunu hatırlayınız).

Okulda genetik parmak izi

Okulda yapılan DNA izolasyonu sonucu alkolle çökertilen ve pamuk gibi görünen DNA zincirlerininin tüm bir organizmayı kodlayan genom olduğunu gördüklerinde öğrenciler bir ‘Vaovvv’ çekerler. Bunu tükürük^w6 (veya ticari olarak elde edilebilen epitel hücreler), bezelye (Madden, 2006), domates, soğan^w7 veya dana timusu (okulda dana timusu kullanımına yönelik yerel kısıtlamaların olabileceğine dikkat ediniz)^w8 kullanarak okulda yapmak kolaydır.

Daha sonra insan DNA’sındaki özel bir STR’nin (örn., D1S80 veya TH01) PCR’ı gerekirse gerekirse fiyatı uygun ticari kitler^w9 kullanılarak okulda yapılabilir^w6. Eğer okulunuzda PCR makinesi yoksa, ayrı sıcaklıklara ayarlanmış üç su banyosu kullanılabilir (ancak bu, yorucu ve elle yapılmasını gerektrir).

Bu cihaz mevcut değilse, genetik parmak izi^w10’nin tüm işlemini hem kolaylaştıran hem de simüle eden kitler vardır. Bu kitler, tek STR ve VNTR’nin farklı allellerinin amplifikasyonunu taklit eden DNA fragmentleri içermektedir. (Aslında, bunlar plazmid ya da DNA’nın lamda fajından gelen DNA’nın restriksiyon fragmentleridir.) DNA’nın elektroforezine ve daha sonra boyanmasına ihtiyaç duyulacaktır ki, böylece öğrenciler bir kanıt örneğinden amplifiye edilmiş DNA dizilerini birçok şüphelinin DNA dizileri ile karşılaştırabileceklerdir. Elbette, bu elektroforetik otomatik dizileme kullanılarak amplifiye edilmiş STR’lerin tespitinden çok farklıdır (ve DNA’nın jel üzerinde direkt olarak boyandığı Southern blotlama kullanılarak bile VNTR’lerin görüntülenmesi doğru bir şekilde temsil edilmemektedir), Ancak yine de analitik bir işlemin ilkelerini göstermektedir. Bu simülasyon kitleri kullanıldığında, deneylerin bireyler arasındaki farklılıkları kolayca ortaya koyabileceği izlenimi verir. Ancak gerçekte durumun bu olmadığı öğrencilerin dikkatine sunulmalıdır.

Teşekkür

Yazarlar, makale hakkındaki düşünceleri ve Science Bridge eğitimlerine ücretsiz olarak izin verdiği için Wolfgang Nellen’a teşekkür etmektedirler.

Ayrıca yazarlar, okulda kullanılan ticari kitlerle ilgili tavsiyeleri için Shelley Goodman’a minnettardırlar.