Şekeri saptamak: Şeker hastalığıyla yüzleşildiğinde karşılaşılan günlük bir sorun Teach article

Tercüme eden: Buse Andaç, Osman Toker, Büşra Çağlar, Ahsen İlkyaz Yumuşak, Canbolat Gürses, Hikmet Geçkil (Department of Molecular Biology and Genetics, Inonu University). ExploHeidelberg Eğitim Laboratuvarı’ndan Fred Engelbrecht ve Thomas Wendt şeker hastalarının her gün…

Diyabet, bir modern uygarlık hastalığı

Bir monosakkarit olan glükoz, canlı ökaryotik organizmalardaki en önemli enerji kaynağı olup, aerobik veya anaerobic solunumda hücreler tarafından kullanılır. Aynı zamanda, protein üretiminde ve lipid metabolizmasında da bir öncül olarak görev yapar. Bu sebeple, glükoz bir çok metabolik yolda merkezi bir moleküldür ve kan dolaşımındaki konsantrasyonu insülin ve glukagon tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmelidir.

Diabetes mellitus (veya basitçe diyabet), bozulmuş glukoz metabolizması ve aşırı yüksek kan şekeri seviyeleriyle (hiperglisemi) karakterize bir sendromdur. Bunun sebebi, insülin hormon düzeyinin düşük olması veya insülinin etkisine karşı anormal bir dirençle birlikte, direnci telafi etmek için salgılanan insülin seviyesinin de çok düşük olmasıdır.

İki ana çeşit diyabet vardır: Tip-1 ve Tip 2. İki çeşidin farklı nedenleri olmasına rağmen, genel olarak her iki tipteki hastalarda pankreastaki beta hücreleri hiperglisemiyi önlemek için yeterli seviyede insülin üretemez.

Tip-1 diyabet Avrupa’daki diyabet vakalarının yaklaşık %10’unun oluşturur ve genellikle otoimmun yıkım sonucu pankreatik beta hücrelerinin kaybıyla karakterizedir. Tip-1 diyabet sıklıkla genç yaştaki hastaları etkilediğinden juvenil (gençlik) diyabeti olarak da adlandırılır. Tedavisi olmadığı için diyabetin en şiddetli şeklidir. Hastalar diyetlerini düzenleyerek, düzenli egzersiz yaparak ve kan şekeri düzeylerini ölçerek yaşam biçimlerini ayarlamalıdırlar. Bunlara ilaveten, komaya girmekten veya ölümden kaçınmak için derialtı enjeksiyonu ya da bir pompa ile insülinin kan dolaşımına sürekli verilmesi gerekmektedir.

Tip-2 diyabet, insülin direnci ya da yetersiz insulin salınımıyla birlikte hedef dokulardaki azalmış insülin duyarlılığından kaynaklanmaktadır. Vücut dokularının insüline düşük yanıtı, hücre membranlarındaki insülin reseptörleri ile ilgilidir. Bu durum, normal kan şekeri düzeylerini sürdürmek için vücudun anormal derecede yüksek miktarda insüline ihtiyaç duymasına neden olur ve beta hücreleri bu talebi karşılayamadığı zaman diyabet gelişir. Genellikle yetişkin başlangıçlı diyabet olarak da bilinen Tip-2 diyabet, çoğunlukla 30 yaşından sonra ortaya çıkar. Çoğu durumda, obezite ve çok az fiziksel aktiviteyle bağlantılıdır ve daha sağlıklı bir yaşam tarzına geçmek hastalık durumunu iyi yönde geliştirebilir veya bazı durumlarda tedavi bile edebilir. Diyabetin daha fazla detayı için Dugi’ye (2006) bakınız.

Herhangi bir çeşit diyabetten etkilenen insanlar hastalığın semptomları ile nasıl yaşanacağını öğrenmeye ihtiyaç duyarlar. Bu semptomlar arasında sık idrara çıkma, su içmede artış ve bunun sonucu olarak da sıvı alımında artış sayılabilir. Diyabetten etkilenen çocuk sayısı yüksek olduğu için öğrencileri diyabet hakkında erken bir aşamada bilgilendirmek gerekir. Diyabet hastaları semptomlarını en aza nasıl indirgeyebileceklerini veya sağlıklı beslenme ve yeterli egzersizle ile diyabeti nasıl önleyebileceklerini öğrenmelidirler. Sağlıklı çocuklar diyabetli arkadaşlarının ihtiyaçlarını anlamalıdır.

Bu nedenle öğrencilerin karbohidratları tanımasına olanak sağlayan bazı deneyler yaptık. Bu deneylerin bir bölümünde amacımız solüsyonun nişasta, protein veya glükoz, laktoz, sükroz gibi şekerleri içerip içermediğini belirlemekti. Solüsyondaki şekerin türü belirlendikten sonra, bir enzimatik reaksiyon kullanarak hangi örneklerin laktoz veya glükoz içerdiğini belirleyen başka deneyler kararlaştırıldı. Bu deneylerin prensibi diyabet teşhisi için kandaki glükoz seviyesinin ölçümü veya örneğin meyve sularında, süt ve süt ürünlerindeki glükoz/laktoz miktarlarını ölçmek için kullanılan yöntemlerle aynıdır. Bu nedenle, bu deneyler öğrencilere diyabet hastalarının şeker düzeylerini nasıl görüntüleyebildikleriyle ilgili bir fikir vermiştir.

Deney 1: Şeker, nişasta ve proteinin tespiti

Öğrenciler, nişasta, protein (sığır serum albümini), monosakkarit glükoz veya disakkaritlerden laktoz veya sükrozu içeren A’dan E’ye kadar etiketlendirilmiş beş numuneyi alırlar. Tüm çözeltiler su içinde 0.1% konsantrasyonundadır. Ayrıca glükoz içeren renksiz enerji içeceklerinin örneklerini de (örneğin Powerade®-Limon) test edebilirsiniz. Öğrenciler, farklı belirteç solüsyonları kullanarak, beş numuneden hangisinin şeker, nişasta veya protein içerdiğini belirlemelidir.

Çiftler halinde çalışan 30 öğrenciden oluşan bir sınıf için aşağıdaki çözeltilere ihtiyacınız olacaktır:

• Aynı miktarda açık mavi Fehling I çözeltisi (100 ml distile suda çözülmüş 7 g CuSO₄·5H₂O) ve renksiz Fehling II çözeltisinden (35 g C₄H₄KNaO₆·4H₂O ve 100 ml distile suda çözülmüş 10 g NaOH) karıştırılarak yapılan taze Fehling çözeltisi. Çözelti kullanılmadan önce kısa bir süre karıştırılmalıdır.
• 1 g iyot (I₂) ve 2 g potasyum iyodürün (KI) 50 ml distile suda çözünmesiyle yapılan Lugol solüsyonu.
• Bradford yöntemi ile protein tayini için Coomassie Brilliant Blue boyası ticari olarak (örn., Biorad^w1) temin edilebilir.

a) İndirgeyici bir şekeri belirleme (Fehling reaksiyonu)

1. Beş farklı tepkime tüpünün her birine A’dan E’ye kadar olan çözeltilerin her brinden 1 ml pipetleyin ve içeriği 2 dakika su banyosunda 60°C’de ısıtın.
2. 16 μl koyu mavi taze Fehling solüsyonunu her reaksiyon tüpüne ilave edin ve tüpleri 60°C’de 10 dakika daha  görünür bir renk reaksiyonu ve bir çökelti oluşana kadar inkübe edin.

Fruktoz, glükoz veya laktoz gibi indirgeyici şekerler içeren çözeltiler kırmızıya dönmelidir ve kırmızı bir çökelti oluşmalıdır (çözünmüş bakır (II) iyonları çözünmez bakır (I) oksite indirgenmiştir). Diğer taraftan, sükroz veya nişasta ile renk değişikliği olmamalıdır. Protein çözeltisi soluk mor renge dönmelidir.

b) Nişasta belirleme (Lugol çözeltisi)

1. Beş tane yeni reaksiyon tüpünün her birine A’dan E’ye kadar çözelti örneklerinden 500’er μl pipetleyin.
2. Her tüpe 50 μl Lugol çözeltisi ilave edin ve renk reaksiyonunu gözleyin.

Lugol çözeltisi nişastayı test etmek için bir ayıraçtır. Boya, polisakkarit yapısıyla etkileşime girerse nişastayı boyayacak ve koyu mavi bir renk verecektir. Lugol, monosakaritler (glukoz) veya disakkaritler (laktoz veya sükroz) ile reaksiyona girmeyecektir.

c) Protein belirleme

Protein deneyi, Bradford boya bağlama prosedürüne dayanmaktadır. Bu yöntem, Coomassie Brilliant Blue boyasının proteine bağlanırken rengin değişimini ölçer.

1. Yeni beş reaksiyon tüpünün her birine A’dan E’ye kadar olan solüsyonlardan 20 μl pipetleyin, daha sonra 800 μl deiyonize su ve 200 μl Coomassie Brilliant Blue boya (Bradford reaktifi) ekleyin.
2. Reaktifleri karıştırın, reaksiyonu 5 dakika bekletin ve renk reaksiyonunu gözleyin.

Protein varlığında, solüsyon maviye dönüşecektir (bir fotometrede 595 nm’de ölçülebilir). Şeker veya nişasta içeren numuneler renk değiştirmez.
 

Sonuçlar ve yorum

Çözelti B, Lugol çözeltisi ile pozitif bir reaksiyon verir, böylece nişasta içerdiğini ortaya koymaktadır. D çözeltisi Bradford tayininde pozitif bir sonuç vererek, kendisinin  bir protein çözeltisi olduğunu ortaya koyar. Çözeltiler A ve C, Fehling reaksiyonu sırasında kırmızı bir çökelti verir ve bu nedenle indirgeyici şeker örnekleri glükoz ve laktoz olarak tanımlanabilirler (ancak bu aşamada hangisinin glükoz hangisinin laktoz olduğunu söylemek mümkün değildir). Geri kalan çözelti E, testlerin herhangi biriyle hiçbir reaksiyon göstermediğinden sükroz çözeltisi olmalıdır.

Deney 2: Şekerin enzimatik tayini

Bu ikinci deneyde, kalan iki A ve C solüsyonlarının hangisinin laktoz, hangisinin glükoz içerdiğini anlamak için yeni bir test yapılır. Bu deney için piyasada var olan, BioControl ^w2’den satın alınabilen EnzyPlus EZS 962+ laktoz/D-glükoz kitini kullanırız. Prosedür, kan şekeri seviyelerini görüntülemek için diyabet hastaları tarafından rutin olarak kullanılan prosedüre benzemektedir. Ürün için standart protokol değiştirildi ve ölçek küçültüldü, böylece sağlanan belirteçlerle daha fazla sayıda deney yapılabilir. Bir kit 20 çift öğrenci için yeterli malzeme sağlamaktadır.

Test prensibi aşağıdaki gibidir (aşağıdaki şekillere bakınız):

• Disakkarit laktoz, β-galaktosidaz enzimi ile D-galaktoz ve D-glükoza hidrolize edilir. (Aşağıdaki 1. Aşama).
• ATP varlığında, D-glükoz hekzokinaz ile glükoz-6-fosfat’a spesifik olarak fosforile edilir; eş zamanlı olarak adenozin-5’-difosfat (ADP) oluşur (Aşama 2).
• Glükoz-6-fosfat, glükoz-6-fosfat dehidrogenaz tarafından glikonat-6-fosfat’a oksitlenir.
• Reaksiyon boyunca, NADP⁺ NADPH’a indirgenir. Bu reaksiyonda oluşan NADPH miktarı laktoz miktarına göre stokiyometriktir ve 340 nm’deki absorbans artışı ile fotometrik olarak ölçülebilir.

Reaksiyonu gerçekleştirmek için:

1. Dört adet 1.5 ml reaksiyon tüpünü alıp A+, A-, C+, C- olarak etiketleyin. Her bir tüp içine 100 µl ayıraç tamponu R4b (fosfat tamponu pH 6.6) koyun ve tüp A+ ve C+ içine 5 µl  b-galaktosidoz çözeltisi R4a ekleyin (fakat A- ve C- tüplerine değil).
2. A+ ve A- tüplerine 100 µl solüsyon A ve etiketlenmiş olan C+ ve C- tüplerine 100 µl C solüsyonu ekleyin.

Not: Bu deneyin kalan aşamalarında, dört örneğin tümü aynı şekilde muamele edilir.

3. Laktoz hidrolizi gerçekleşirken tüm örnekleri 30 dakika boyunca 37°C’de bir su banyosuna bırakın.
4. İnkübasyondan sonra, dört reaksiyon tüpünün hepsine 1 ml distile su, 200 µl reaksiyon tamponu R1 ve 50 µl R2 ayıracı (sırasıyla ATP ve NADP içeren) ilave edin ve iyice karıştırın.  
5. Her bir reaksiyon karışımının 1 ml’sini ayrı fotometre küvetlerine aktarın ve 2 dakika sonra 340 nm’de (OD₃₄₀) optik yoğunluğu ölçün.
6. Her bir küvete, glükoz-6-fosfat dehidrogenaz ve hekzokinaz içeren R3 enzim karışımından 7 µl ekleyin, 5 dakika daha inkübe edin ve 340 nm’deki absorbansı tekrar ölçün.  
    

Sonuçlar ve yorum

Başlangıçta NADPH olmadığından,  dört örneğin hepsi düşük absorbsiyon değerleri vermelidir. İkinci ölçüm (enzimleri ekledikten sonra), A ve C solüsyonlarının ayırt edilmesine izin vermelidir. Çözelti A, b-galaktosidazın eklenip eklenmemesine bakılmaksızın pozitif sonuçlar verdiği için bunun glükoz içerdiği sonucuna varılabilir. Bunun aksine, C solüsyonunun absorbsiyonundaki bir değişiklik sadece laktoz içerdiğini gösteren b-galaktosidaz (C+) varlığında ölçülmelidir.

Uygulama sırasında, katılımcılar diyabet ve diyabetli hastaların karşılaştığı sorunlarla ilgili temel bilgiler elde ederler. Hastalar kan şekeri seviyesini belirlemek için, Deney 2’de kullanılan ilkeye dayanan bir glükoz-izleme test çubuğu sistemi kullanmaktadır. Bu tür deneylerin yapılması şeker hastalığının farkındalığını arttırabilir ve yaşam tarzı değişiklikleri yoluyla hastalıktan nasıl sağ kalınabileceğini veya hastalığın önlenebileceğini gösterebilir.

Burada açıklanan deneyler normal okul laboratuvarlarında güvenle yapılabilir çünkü kullanılan belirteçler Tehlikeli Maddeler Yönetmeliği’ne (EC Yönetmeliği 67/548/EEC) göre tehlikeli maddeler sınıfında değildir. Belirteçlerdeki koruyucu olan sodyum azitin seviyesi, 1999/45/EC sayılı yönergeye göre bir preparat için en düşük toksisite düzeyinin altındadır.
 

Download

Download this article as a PDF