Amprentarea genetică: o privire în interior Understand article

Tradus de Nadia Bucurenci. În serialele TV poliţiste, infractorii sunt identificați, de cele mai multe ori, prin amprentare genetică. Sara Müller şi Heike Göllner-Heibült aruncă o privire în culise.

Ideea de a identifica oamenii pe baza caracteristicilor genetice nu este nouă. Grupele sanguine ABO, descoperite în 1900 de Karl Landsteinerr^w1, au constituit primul marker genetic folosit în criminalistică, la care s-au adăugat grupele sanguine MN (1927) şi factorul Rhesus (1937).

Dar, chiar dacă analizăm simultan toate cele trei sisteme de grupe sanguine, obţinem rezultate identice pentru una din zece persoane; din cauza asta sunt posibile transfuziile de sânge. Din punct de vedere criminalistic, însă, este un dezavantaj. Rezultatele îţi pot spune că proba de sânge nu provine de la Suspectul X, dar nu pot confirma, cu certitudine, că provine de la Suspectul Y.

În anii 1970 şi ‘80 s-au făcut progrese, analizându-se diferitele forme ale unor enzime (izoenzime) din hematii şi ser sanguin. Certitudinea că proba provenea întradevăr de la suspect depindea de numărul de proteine analizate (de obicei patru); această certitudine se numeşte capacitate de discriminare. Capacitatea de discriminare oferită de aceste tehnici combinate este de numai 1:1000, mai bună decât capacitatea de 1:10 a analizei grupelor sanguine, dar încă nu suficient de bună. Pentru a obţine o discriminare mai bună, era nevoie să ne analizăm mai amănunţit structura genetică.

Structura noastră genetică – cine suntem

Genomul uman este constituit din 46 perechi de cromozomi: 23 de la mamă, 23 de la tată. Avem, aşadar, câte doi din fiecare cromozom (excepţie – în cazul bărbaţilor – cromozomii sexuali) şi, astfel, două copii ale fiecărei gene.

Componentul principal al cromozomilor este acidul deoxiribonucleic (ADN), care conţine informaţii pentru producerea proteinelor necesare vieţii. Totuşi, din cele 3 miliarde de perechi de baze (pb), numai aproximativ 4% codifică proteine, restul sunt adesea doar de „umplutură” constând din secvenţe repetitive organizate în aglomerări (clusters). Dacă se compară ADN-ul a două persoane, el este identic în cea mai mare parte, variabilitatea găsindu-se mai ales în aceste secvenţe repetitive.

La persoane diferite aceste secvenţe sunt repetate de un număr diferit de ori: o persoană poate avea cinci repetiţii într-un locus (situs) ADN specific, altă persoană poate avea şapte. Folosind probe, de ex. din sânge sau spermă, putem analiza secvenţele repetitive din mai mulţi loci ADN; această analiză se numeşte amprentă genetică. La fel ca amprentele digitale, amprentele genetice pot fi folosite pentru identificarea persoanelor.

Deşi termenul ‚amprentare genetică’ (sau identificarea profilului genetic) este folosit curent, nu toată lumea ştie că el cuprinde două tehnici foarte diferite, dintre care numai una este folosită curent în practica criminalistă.

Amprentarea genetică timpurie: polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie

Prima metodă de amprentare genetică a fost inventată în 1984 de Alec Jeffreys^w2, are a folosit secvenţele ADN cunoscute ca ‘număr variabil de repetiţii în tandem’ (VNTR – variable number tandem repeats; de ex. Secvenţa D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n). Aceste secvenţe, cu 10-100 pb per repetiţie, pot fi analizate folosind enzime de restricţiec, care funcţionează ca foarfeci moleculare şi taie ADN-ul la nivelul unor secvenţe specifice (secvenţe de recunoaştere). În întregul genom, o secvenţă de recunoaştere de 6 pb apare de circa 730 000 de ori.

Asta înseamnă că, dacă se taie genomul cu o anumită enzimă de restricţie, se obţin aproximativ 730 000 fragmente de restricţie de lungimi diferite. Şi aici devin importante VNTR-urile: numărul de repetiţii într-o aglomerare VNTR particulară poate varia între indivizi, ceea ce înseamnă că şi lungimea fragmentelor respective de restricţie este diferită între indivizi (Figura 1). Numim acest fenomen polimorfismul lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP – restriction fragment length polymorphism).

Dintre cele 730 000 fragmente de restricţie, numai câteva vor fi diferite între indivizi – prea puţine ca să fie văzute cu ochiul liber. În loc de asta, cercetătorii folosesc o tehnică numită Southern blotting, care permite să fie vizualizate numai secvenţele de interes. Pentru asta, ei separă fragmentele de restricţie în funcţie de mărime, prin electroforeză în gel, folosind curentul electric ca să facă fragmentele de ADN încărcate electric să se deplaseze în gel. Distanţa parcursă este determinată de mărimea fragmentului (Figura 2, Pasul 1). În continuare, ei transferă ADN-ul pe o membrană (Figura 2, Pasul 2) şi utilizează o sondă marcată radioactiv care este complementară cu VNTR-urile de interest. Are loc procesul de hibridizare (ataşare) a sondei cu secvenţele corespunzătoare (Figura 2, Pasul 3) şi, punând membrana peste un film radiografic, se obţine o imagine a benzilor marcate radioactiv, fiecare reprezentând un fragment de lungime diferită (Figura 2, Pasul 4). Această imagine este amprenta genetică.

Câte VNTR-uri trebuie comparate pentru a identifica cu certitudine o persoană ? Dacă cercetătorii aleg VNTR-uri cu suficiente variante (de ex. D1S80, care poate fi repetat de 15 până la 41 de ori), ei trebuie să compare doar patru VNTR-uri diferite pentru a ajunge la o capacitate de discriminare de 1:1 milion – mult mai bună decât discriminarea de 1:10 oferită de tiparea ABO.

Tehnica actuală: amprentarea genetică prin PCR

Kary Mullis’ invention, in 1983, of the polymerase chain reaction (PCR) won him the Nobel Prize in Chemistry^{w3, w4}. Descoperirea, la sfârşitul anilor 1980, a ‚repetiţiilor de secvenţe scurte în tandem’ (STR – short tandem repeats) – secvenţe de 2-9 pb repetate, numite şi microsateliţi -, împreună cu inventarea PCR, au deschis drumul pentru tehnica rapidă de amprentare genetică folosită astăzi de criminalişti.

Prin PCR, un locus ADN de interes (de ex. STR-ul de 4 pb cunoscut ca D18S51, (AGAA) n) este amplificat exponenţial, generându-se un miliard de copii ale unei singure molecule de ADN în câteva ore (Figura 3). Pentru criminalişti, avantajul este că se poate analiza astfel chiar şi cea mai mică probă – începând cu 30 de celule (observați în Tabel 1 comparaţia cu amprentarea genetică bazată pe RFLP).

Pentru analiza PCR, avem nevoie de STR-uri flancate de secvenţe comune tuturor fiinţelor umane (numim aceste secvenţe conservate). Atunci putem folosi primeri (amorse) – molecule scurte complementare secvenţelor marginale conservate (genele 1134 şi 1135 în Figura 4) – pentru a iniţia PCR. Odată ADN-ul amplificat, îl putem separa fie prin electroforeză în gel (Figura 5) fie, în medicina legală modernă, prin secvenţiere electroforetică automată (Figura 6), and visualise it as a genetic fingerprint.

Există două copii ale fiecărui cromozom, deci vom avea câte două copii pentru fiecare STR. Dacă o persoană are acelaşi număr de repetiţii (adică aceleaşi alele) pentru fiecare copie a STR, din analiza PCR vor rezulta fragmente de ADN de aceeaşi mărime: individul este homozigot pentru alela STR respectivă (săgeata verde în Figura 5, corespunzând individului 2 din Figura 4). Dacă cei doi cromozomi conţin alele diferite pentru acel STR, vom obţine fragmente de două mărimi şi spunem că individul este heterozigot (săgeata roşie în Figura 5, corespunzând individului 1 din Figura 4).

Dacă analizăm un singur STR, şansele ca două persoane neînrudite să aibă aceeaşi amprentă genetică obţinută prin PCR sunt mari – între 1:2 şi 1:100 (săgeţi albastre în Figura 5). Motivul este că STR-urile au mai puţine alele şi heterozigozitate mai scăzută decât VNTR-urile folosite pentru amprentarea genetică bazată pe RFLP. Pentru a depăşi acest dezavantaj, analizăm simultan mai multe STR-uri; cu 16 STR, aşa cum este uzual în criminalistica din Germania, putem obţine o capacitate de discriminare de 1:1 miliard (echivalent cu o persoană din populaţia lumii; Figura 6).

Aplicații ale amprentării genetice

Ştim acum ce este amprentarea genetică, dar cum se foloseşte ea? Amprentarea genetică prin PCR are o largă aplicare în criminalistică: ea permite poliţiei să elimine sau să identifice suspecţi pe baza materialelor genetice cum ar fi foliculi de păr, piele, spermă, salivă său sânge (citiți povestirea care poate fi descărcată mai jos^w5). Totuşi, amprenta genetică singură nu este o dovadă suficientă pentru condamnare, întrucât rudele apropiate pot avea amprente foarte asemănătoare (iar gemenii monozigoţi le au identice).

În plus, pentru a complica investigaţiile criminalistice internaţionale, deşi există o recomandare Europeană de a analiza 16 STR-uri, fiecare ţară decide care STR-uri vor fi analizate, ceea ce face ca rezultatele să fie dificil de comparat.

Metoda bazată pe PCR este folosită, la oameni, şi pentru testarea paternităţii, diagnosticarea maladiilor genetice (de ex. Maladia Huntingdon), identificarea victimelor catastrofelor, trasarea arborelui genealogic, căutarea persoanelor dispărute şi studierea personajelor istorice (de ex. Ultimul ţar al Rusiei şi familia sa). În cazul altor organisme, poate fi folosită în scopul protecţiei mediului (de ex. pentru analiza fildeşului confiscat), în investigaţiile privind drogurile (de ex. pentru analiza plantelor de canabis capturate), pentru controlul calităţii apei şi alimentelor (de ex. prin identificarea microbilor contaminanţi), în medicină (de ex. pentru detectarea infecţiilor virale cum ar fi HIV, hepatita sau gripă) şi în investigaţiile privind bioterorismul (de ex. pentru identificarea tulpinilor microbiene).

Amprentarea genetică prin RFLP, deşi considerată depăşită din cauza avantajelor evidente oferite de metoda PCR (Tabel 1), este încă folosită pentru clasificarea plantelor şi animalelor în cercetarea fundamentală. Ea este utilă în special atunci când nu există suficiente informaţii despre genomul unor specii – amintiţi-vă că, pentru metoda PCR, avem nevoie de regiuni cu variaţii mari între indivizi şi care sunt flancate de regiuni conservate cu secvenţe cunoscute.

Amprentarea genetică la școală

Izolarea ADN în clasă le va provoca elevilor un moment de uimire atunci când vor realiza că, în cele câteva filamente de ADN precipitat cu alcool, care seamănă cu nişte şuviţe de vată, au în faţa ochilor informaţia genetică completă care codifică un organism. Este un experiment uşor de făcut la şcoală folosind salivă^w6 (sau celule epiteliale dintr-un kit comercial), mazăre (Madden, 2006), roşii, ceapă^w7 sau timus de viţel (deşi trebuie verificate restricţiile locale privind utilizarea timusului de viţel la şcoală)^w8.

PCR-ul unui STR specific din ADN-ul uman, de exemplu D1S80 sau TH01, se poate realiza la şcoală^w6, folosind la nevoie kit-uri^w9 disponibile comercial. Dacă şcoala nu are acces la un termociclu, ciclul termic poate fi realizat folosind trei băi de apă, deşi este incomod şi foarte laborios.

Dacă acest echipament nu este disponibil, există kit-uri care simulează şi, în acelaşi timp, simplifică întregul proces de amprentare genetică^w10. Aceste kit-uri conţin fragmente de ADN care simulează amplificarea diferitelor alele ale unui singur STR sau VNTR. (De fapt, sunt fragmente de restricţie din ADN-ul unui plasmid sau fag lambda). ADN-ul are nevoie de electroforeză şi colorare ulterioară pentru ca elevii să poată compara secvenţele de ADN amplificate dintr-o probă biologică cu cele ale mai multor suspecţi. Bineînţeles, asta este foarte diferit de detectarea STR-urilor amplificate prin secvenţiere electroforetică automată (şi nu ilustrează corect nici vizualizarea VNTR-urilor în Southern blotting, pentru că ADN-ul este colorat direct în gel), dar demonstrează, totuşi, principiile procesului analitic. Când se folosesc aceste kit-uri de simulare, elevilor trebuie să li se atragă atenţia că experimentele dau impresia că diferenţele dintre indivizi sunt uşor de identificat, ceea ce nu este adevărat.

Mulțumiri

Autorii doresc să îi mulţumească lui Wolfgang Nellen pentru contribuţiile la articol şi pentru permisiunea de a folosi gratuit instrucţiunile din Science Bridge.

Mulţumiri şi lui Shelley Goodman pentru consultanţa în privinţa utilizării kiturilor comerciale în şcoală.