Ανακαλύπτοντας τη δράση της ουρεάσης Teach article

Μετάφραση από: Μαρίνα-Σαββίνα Τσατσαλίδη (Marina-Savvina Tsatsalidi) – Φοιτήτρια Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ και Παναγιώτη Κ. Στασινάκη (Panagiotis K. Stasinakis) - Εκπαιδευτικός, Βιολόγος, MEd, PhD,…

Τα ένζυμα διαδρματίζουν σημαντικότατο ρόλο στο μεταβολισμό όλων των οργανισμών. Καταλύουν και ελέγχουν τις περισσότερες βιοχημικές αντιδράσεις στο σώμα μας – από την αντιγραφή της γενετικής πληροφορίας (DNA πολυμεράση) μέχρι την πέψη. Η ενζυμική δραστηριότητα, παρόλα αυτά, δεν είναι πάντοτε εύκολο να οπτικοποιηθεί. Στην παρούσα εργασία περιγράφεται ένα απλό και φθηνό πρακτικό πρωτόκολλο για να βοηθήσει στη διδασκαλία της ενζυμικής ενεργότητας στην τάξη. Όλα τα απαιτούμενα υλικά είναι εύκολα διαθέσιμα και ασφαλή.

Σ’ αυτήν την έρευνα, το ένζυμο ουρεάση που υπάρχει στα φασόλια σόγιας (Glycine max) διασπά την ουρία σε αμμωνία και διοξείδιο του άνθρακα:

CO(NH₂)₂ + H₂O → 2 NH₃ + CO₂

Το διάλυμα αμμωνίας (NH₃) έχει υψηλό pH, το οποίο μπορεί να ανιχνευτεί χρησιμοποιώντας έναν απλό δείκτη, σαν αυτόν του κόκκινου λάχανου. Η αμμωνία που παράγεται από την αντίδραση μπορεί επίσης να ανιχνευτεί και από τη μυρωδιά.

Επειδή η ουρεάση παράγεται από ένα ευρύ φάσμα διαφορετικών οργανισμών, αυτή η δραστηριότητα μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μαθήματα σχετικά με:

• Τον κύκλο του αζώτου
• Την επίδραση των οργανισμών στο περιβάλλον τους
• Την προσαρμογή των ζώων σε διαφορετικές δίαιτες.

Υπόβαθρο για το πρωτόκολλο

Τι είναι η ουρία;

Όλοι οι οργανισμοί αποικοδομούν νουκλεϊκά οξέα και πρωτεΐνες , παράγοντας νιτρογενή απόβλητα επειδή τα νουκλεϊκά οξέα και οι πρωτεΐνες περιέχουν άζωτο. Τα θηλαστικά, τα αμφίβια και μερικά ασπόνδυλα εκκρίνουν νιτρογενή απόβλητα όπως η ουρία, η οποία παράγεται στο ήπαρ. Η ουρία είναι ιδιαίτερα καλή χημική ένωση για την αποβολή του αζώτου, καθώς είναι υδατοδιαλυτή και λιγότερο τοξική από την αμμωνία – το παράγωγο που αποβάλουν τα ψάρια, για παράδειγμα. Τα ανθρώπινα ούρα περιέχουν 2% ουρία.

Η ουρία ήταν επίσης η πρώτη οργανική ουσία που συντέθηκε. Το 1828, ο Friedrich Wöhler συνέθεσε ουρία από ανόργανες ενώσεις (κυανιούχο μόλυβδο και υδροξείδιο του αμμωνίου). Αυτό το επίτευγμα ήταν ορόσημο, καθώς μέχρι τότε πιστευόταν ότι μόνο οι ζωντανοί οργανισμοί μπορούν να παράγουν οργανικές ουσίες. Αυτές οι ουσίες θεωρούνταν ξεχωριστές και θεωρούνταν ότι απαιτούσαν μια «ζωϊκή δύναμη» για να δημιουργηθούν. O Wöhler γεφύρωσε το χάσμα μεταξύ του έμβιου και του άβιου κόσμου. Παρόλα αυτά δεν βραβεύτηκε με το βραβείο Νόμπελ για την ανακάλυψή του, καθώς τα βραβεία Νόμπελ δεν υπήρχαν εκείνη την εποχή. Σήμερα η ουρία συντίθεται σε τεράστιες ποσότητες: χρησιμοποιείται στην κατασκευή πλαστικών και σαν φθηνό νιτρογενές λίπασμα.

Τι είναι η ουρεάση;

Η ουρεάση καταλύει την υδρόλυση της ουρίας σε διοξείδιο του άνθρακα και αμμωνία. Υπάρχει κυρίως σε σπόρους, μικροοργανισμούς και στα ασπόνδυλα. Στα φυτά, η ουρεάση είναι ένα εξαμερές –αποτελείται από έξι πανομοιότυπες αλυσίδες- και βρίσκεται στο κυτόπλασμα. Στα βακτήρια, αποτελείται είτε από δυο είτε από τρεις διαφορετικές υπομονάδες. Για να ενεργοποιηθεί, η ουρεάση χρειάζεται να προσδεθούν δυο ιόντα νικελίου σε κάθε υπομονάδα.

Πώς έγινε γνωστή η ουρεάση;

Η ουρεάση από φασόλια σόγιας (Canavalia ensiformis) έγινε το πρώτο ένζυμο που καθαρίστηκε και κρυσταλλώθηκε, το 1926, από τον James B. Sumner, σε μια εποχή που οι περισσότεροι επιστήμονες πίστευαν ότι ήταν αδύνατο να κρυσταλλωθούν τα ένζυμα. Ο Sumner έλαβε για τη συμβολή του αυτή το βραβείο Νόμπελ Χημείας το 1946. Σήμερα, η κρυστάλλωση των πρωτεϊνών βοηθάει τους επιστήμονες ανακαλύψουν τη δομή τους και να μάθουν τη λειτουργία τους. Αυτή η γνώση επιτρέπει το σχεδιασμό ουσιών που επεμβαίνουν στην ενζυμική δράση, όπως τα φάρμακα κατά του AIDS που εμποδίζουν τα ένζυμα του ιού HIV να δράσουν, ή ακόμα και εξελίξεις στην έρευνα για μια πιθανή αντιλυσσική θεραπεία (Ainsworth, 2008).

Γιατί υπάρχει ουρεάση στα φασόλια σόγιας;

Ο ρόλος της ουρεάσης στα φασόλια σόγιας δεν είναι εντελώς ξεκάθαρος, παρόλο που μπορούν να γίνουν υποθέσεις. Τα φύλλα σόγιας περιέχουν επίσης ουρεάση, αλλά σε αυτά το ένζυμο είναι χιλιάδες φορές λιγότερο ενεργό από ότι στα φασόλια. Είναι γνωστό ότι το ένζυμο των φύλλων της σόγιας βοηθάει στην ανακύκλωση του αζώτου από πρωτεΐνες (οι πρωτεΐνες διασπώνται σε ουρία). Στα φασόλια, η ουρεάση κάνει το ίδιο όταν τα φασόλια βλασταίνουν. Η αμμωνία που παράγεται από την αντίδραση μπορεί επίσης να προστατέψει τα φυτικά κύτταρα από παθογόνα –φαίνεται πως το ίδιο το ένζυμο του φυτού είναι εντομοκτόνο.

Πού αλλού μπορεί να βρεθεί η ουρεάση;

Πολλά είδη βακτηρίων παράγουν ουρεάση, περιλαμβανομένου και του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού (Helicobacter pylori), του βακτηρίου που είναι υπεύθυνο για τα έλκη στομάχου. Κατ’ αυτόν τον τρόπο το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού αυξάνει το pH των γαστρικών υγρών περίπου από 3 σε 7, που είναι και το κατάλληλο pH για την ανάπτυξή του. Ένα εμπορικά διαθέσιμο τεστ για το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού ελέγχει την παρουσία ουρεάσης στην αναπνοή και χρησιμοποιείται σαν διαγνωστικό εργαλείο για τα στομαχικά έλκη.

Τα μηρυκαστικά (όπως οι αγελάδες και τα πρόβατα) έχουν βακτήρια στην άνω κοιλία τους –το πρώτο τμήμα του στομάχου τους- τα οποία συμβάλλουν στην πέψη της κυτταρίνης και τα βοηθούν να πέψουν την φυτική τους τροφή. Τα μηρυκαστικά εκκρίνουν ουρία σ’ αυτό το τμήμα του στομάχου τους, καθώς η ουρία είναι πολύ καλή πηγή αζώτου για τη βακτηριακή ανάπτυξη. Για να παραλάβουν το άζωτο, τα βακτήρια εκκρίνουν ουρεάση για να διασπάσουν την ουρία. Τελικά, τα ζώα πέπτουν τη βακτηριακή μάζα.

Είναι η ουρεάση των φασολιών σόγιας επιβλαβής για τους ανθρώπους;

Η ουρεάση δεν είναι επιβλαβής. Παρόλα αυτά, τα ωμά φασόλια σόγιας περιέχουν άλλες ενώσεις που είναι επιβλαβείς για την υγεία. Για παράδειγμα, υπάρχει μια πρωτεΐνη αναστολέας στα ωμά φασόλια σόγιας, η οποία εμποδίζει το σχετικό με την πέψη ένζυμο, θρυψίνη, να λειτουργήσει και κάνει τα φασόλια αυτά ακατάλληλα για κατανάλωση. Η παρουσία του αναστολέα δεν είναι εύκολο να ανιχνευθεί, αλλά ευτυχώς , έχει ένα παρόμοιο επίπεδο θερμοαντοχής με την ουρεάση – και οι δύο ουσίες απενεργοποιούνται με θερμότητα. Επομένως, για να σιγουρευτούμε ότι ο αναστολέας έχει απενεργοποιηθεί, τα εμπορικά παρασκευάσματα των φασολιών σόγιας (αλεύρι σόγιας ή φαγητά που περιέχουν σόγια, όπως το τέμπε ή το τόφου) ελέγχονται για πιθανή δραστηριότητα ουρεάσης – με έναν πολύ παρόμοιο τρόπο με αυτόν που περιγράφεται εδώ. Εάν δεν μπορεί να ανιχνευτεί καμία δραστηριότητα ουρεάσης, τότε το πιθανότερο είναι ότι και ο αναστολέας έχει απενεργοποιηθεί.

Η ουρεάση στον κύκλο του αζώτου

Το άζωτο είναι απαραίτητο στοιχείο για την ανάπτυξη των φυτών, όμως τα περισσότερα φυτά μπορούν να το χρησιμοποιήσουν μόνο στην μορφή αμμωνίου ή νιτρικού άλατος. Μόνο τα όσπρια (εξαιτίας των βακτηρίων με τα οποία συμβιώνουν) και τα κυανοβακτήρια μπορούν να χρησιμοποιήσουν το στοιχειακό άζωτο απευθείας από τον ατμοσφαιρικό αέρα.

Πολλά ζώα εκκρίνουν ουρία στα ούρα τους. Οι μικροοργανισμοί του χώματος τρέφονται με τα ούρα ζώων, παράγοντας ουρεάση για να μετατρέψουν την ουρία σε αμμωνία, η οποία είναι προσβάσιμη από τα φυτά. Αυτό είναι τμήμα του κύκλου του αζώτου, της διαδικασίας μέσω της οποίας το άζωτο από πρωτεΐνες και άλλες ενώσεις συνεχώς ανακυκλώνεται.

Το πρωτόκολλο

Αυτό το πρωτόκολλο επιτρέπει στους μαθητές να ανιχνεύσουν τη δραστηριότητα ενός φυτικού ενζύμου σε σπόρους. Όταν υπάρχει το υπόστρωμα (ουρία), η ουρεάση το διασπά σε διοξείδιο του άνθρακα και αμμωνία. Διαλυόμενη στο νερό, η αμμωνία αυξάνει το pH, γεγονός που γίνεται αντιληπτό με το δείκτη κόκκινου λάχανου. Στο πείραμα, οι μαθητές παρατηρούν ότι για να πάρουν το επιθυμητό προϊόν (αμμωνία), χρειάζονται, τόσο το υπόστρωμα (ουρία) όσο και το ένζυμο (ουρεάση). Παρατηρούν ότι η ενζυμική δραστηριότητα αυξάνει το pH.

Εκχύλισμα κόκκινου λάχανου – ένας πολύ καλός δείκτης του pH

Σ’ αυτό το πρωτόκολλο, χρησιμοποιούμε εκχύλισμα κόκκινου λάχανου σαν δείκτη του pH. Περιέχει ανθοκυανίνες. Η δομή και το χρώμα των ουσιών αυτών (όταν βρίσκονται σε διάλυμα) είναι ευαίσθητα σε αλλαγές στο pH. Σε pH 7, το διάλυμα είναι βιολετί/μπλε, σε όξινο περιβάλλον γίνεται κόκκινο. Όταν το pH ανέβει πάνω από το 7 και το διάλυμα γίνει αλκαλικό, το εκχύλισμα γίνεται πράσινο. Αυτές οι χρωματικές αλλαγές είναι αντιστρέψιμες- απλά έλεγξε τι συμβαίνει όταν προσθέτεις κιτρικό οξύ και μαγειρική σόδα (διττανθρακική σόδα) το ένα μετά το άλλο.

Υλικά και εξοπλισμός

Για κάθε μαθητή ή ομάδα μαθητών:

• 20 ml 10% διάλυμα ουρίας λιπάσματος (ένα στερεό λίπασμα κατασκευασμένο από καθαρή ουρία)
• 5 ml 10% διάλυμα κιτρικού οξέος (ή κάποιο άλλο διάλυμα χαμηλού pH)
• 5ml 10% διάλυμα διττανθρακικού νατρίου (NaHCO3) (ή άλλο διάλυμα υψηλού pH)
• 40 ml δείκτη από κόκκινο λάχανο, παρασκευασμένο όπως περιγράφεται παρακάτω
• 10 ml εκχύλισμα από φασόλια σόγιας, παρασκευασμένο όπως περιγράφεται παρακάτω (από 1 g αποξηραμένων φασολιών σόγιας)
• 10 ml απεσταγμένο νερό
• Πιπέτες Παστέρ ή ένα πλαστικό καλαμάκι, για τη μεταφορά των διαλυμάτων
• 6 δοκιμαστικοί σωλήνες και ένα στατώ για δοκιμαστικούς σωλήνες.

Για την προετοιμασία του εκχυλίσματος σόγιας και του δείκτη κόκκινου λάχανου, χρειάζονται ένας αναδευτήρας και βραστό νερό, όπως και χάρτινο φίλτρο καφέ και ένα χωνί.

Χρονική διάρκεια

Το πείραμα μπορεί να ολοκληρωθεί σε 30 λεπτά.

Το εναιώρημα φασολιών σόγιας και το εκχύλισμα κόκκινου λάχανου μπορούν να έχουν προπαρασκευαστεί, ή η παρασκευή τους μπορεί να παρουσιαστεί κατά τη διάρκεια του μαθήματος. Η παρασκευή διαρκεί μόνο δέκα λεπτά, αλλά να σημειωθεί ότι τα φασόλια σόγιας πρέπει να έχουν παραμείνει βυθισμένα σε νερό για τουλάχιστον μια ώρα πριν το μάθημα.

Η αντίδραση μεταξύ της ουρεάσης της σόγιας και της ουρίας διαρκεί επίσης περίπου δέκα λεπτά.

Προετοιμασία

Δείκτης κόκκινου λάχανου

1. Κόψτε δυο μεγάλα φύλλα κόκκινου λάχανου σε μακριές λωρίδες και τοποθετείστε τες σε θερμοανθεκτικό περιέκτη όπως ένα ποτήρι ζέσεων. Ρίξτε 200ml μόλις βρασμένου νερού, βυθίζοντας εντελώς τα φύλλα.
2. Μετά από 5 λεπτά, αποσταλάξτε το υγρό και αφήστε το να κρυώσει.
3. Πετάξτε τα φύλλα.

Εκχύλισμα φασολιών σόγιας που περιέχει ουρεάση

1. Βυθίστε τα φασόλια σόγιας στο νερό για τουλάχιστον μία ώρα (προτιμότερο κατά τη διάρκεια της νύχτας).
2. Αναμίξτε τα μουσκεμένα φασόλια σόγιας σε ένα μπλέντερ φαγητού με περίπου 10ml νερού για κάθε ένα γραμμάριο ξηρής σόγιας (μπορεί να χρησιμοποιηθεί το νερό στο οποίο βυθίσατε τα φασόλια σόγιας) μέχρι το μίγμα να γίνει μαλακό (για περίπου 5 λεπτά).
3. Φιλτράρετε τον πουρέ σόγιας μέσα από φίλτρο χαρτιού σε ένα χωνί.
4. Μαζέψτε και κρατήστε το διήθημα, το οποίο περιέχει ουρεάση.

Διερεύνηση

Οι όγκοι που δίνονται παρακάτω είναι για τυπικούς (~10 ml) γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες.

Πρώτα απ’ όλα, ζητήστε από τους μαθητές να ελέγξουν πώς το pH επηρεάζει το χρώμα του εκχυλίσματος κόκκινου λάχανου.

1. Ρίξτε 3 ml δείκτη κόκκινου λάχανου σε κάθε έναν από τρεις σωλήνες.
2. Προσθέστε 2 σταγόνες διαλύματος κιτρικού οξέος στον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα. Ανακατέψτε και παρατηρήστε την αλλαγή του χρώματος. Ξεπλύνετε την πιπέτα με νερό μετά την προσθήκη κάθε ουσίας.    
3. Προσθέστε 2 σταγόνες διττανθρακικής σόδας στον δεύτερο δοκιμαστικό σωλήνα. Ανακατέψτε και παρατηρήστε τη χρωματική αλλαγή.
4. Προσθέστε 2 σταγόνες απεσταγμένου νερού στον τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα . Ανακατέψτε και παρατηρήστε τη χρωματική αλλαγή.
5. Συγκρίνετε και σημειώστε τα χρώματα των διαλυμάτων στους τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες. Κρατήστε τους σωλήνες ως δείγμα αναφοράς.

Κατόπιν, διερευνήστε την επίδραση της ουρεάσης των φασολιών σόγιας στην ουρία.

1. Προσθέστε 2 ml δείκτη κόκκινου λάχανου σε κάθε έναν από τρεις καινούργιους σωλήνες.
2. Αναμίξτε 2 ml διαλύματος ουρίας, με το δείκτη σε κάθε έναν από δυο απ’ αυτούς τους δοκιμαστικούς σωλήνες.
3. Προσθέστε 2 ml από το εναιώρημα σόγιας στον εναπομείναντα σωλήνα και άλλα 2 ml σε έναν από τους σωλήνες με διάλυμα ουρίας.
4. Συγκρίνετε τα χρώματα και τις οσμές των μιγμάτων σε όλους τους σωλήνες. Ξανακάντε τη σύγκριση έπειτα από 3 λεπτά.

Ερμηνεία

Ο δείκτης κόκκινου λάχανου αποκτά πράσινο χρώμα όταν το pH αυξάνεται. Αυτή η χρωματική αλλαγή, μαζί με τη χαρακτηριστική οσμή αμμωνίας, μπορεί να ανιχνευτεί σε έναν σωλήνα που περιέχει και το ένζυμο και το υπόστρωμα. Σε σωλήνες που περιέχουν είτε μόνο το ένζυμο, είτε μόνο το υπόστρωμα, το pH παραμένει σταθερό, επομένως ο δείκτης κόκκινου λάχανου διατηρεί βιολετί χρώμα.

Ασφάλεια

Περίπου το 1% των παιδιών μπορεί να είναι αλλεργικά στο εκχύλισμα των φασολιών σόγιας (δες McGee, 2004). Οι καθηγητές θα πρέπει να ελέγξουν ότι κανένας μαθητής δεν επηρεάζεται από τα εκχύλισμα φασολιών σόγιας προτού αποπειραθεί να εκτελέσει αυτό το πρωτόκολλο.

Περαιτέρω έρευνες

Σαν συνέχεια σ’ αυτό το πείραμα, μπορεί να εκτελεστεί επιπλέον δραστηριότητα στην οποία θα γίνει διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν την ενζυμική δραστηριότητα (όπως θερμοκρασία, pH και συγκεντρώσεις ενζύμου, υποστρώματος και προϊόντος).

Αναγνωρίσεις

Αυτό το πρακτικό πρωτόκολλο αναπτύχθηκε από την Anna Lorenc για το πρόγραμμα Volvox, το οποίο χρηματοδοτείται από το Έκτο Πρόγραμμα- Πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Επιτροπής.
 

Download

Download this article as a PDF