O uso de bases de dados biológicas para ensinar evolução e bioquímica Teach article

Traduzido por Rita Campos. Ferramentas disponíveis na internet podem ser usadas para comparar sequências de proteínas e compreender a evolução de diferentes organismos.

No passado, os cientistas faziam análises evolutivas comparando as características físicas – designadas por fenótipos – das espécies encontradas no registo fóssil. No entanto, desde a descoberta dos relógios moleculares que este cenário mudou.

O conceito de relógio molecular surgiu por se ter observado que quanto mais tempo decorreu desde que duas espécies divergiram de um ancestral comum mais diferente será a sequência do seu ADN ou proteína (para uma revisão, ver Bromham & Penny, 2003).

Comparando sequências de genes ou proteínas homólogos – noutras palavras, sequências de dois organismos com um ancestral comum directo – pode-se medir o tempo que passou desde que os organismos divergiram. E isso pode ser visualizado numa árvore filogenética.

Para verificar quão similar dois genes são, é preciso ter as suas sequências e alinhá-las correctamente (Kozlowski, 2010). Conseguir essas sequências costumava ser muito difícil mas não agora.

Os seus estudantes provavelmente já lhe disseram que está tudo na internet – desta vez, eles estão certos. Há muitos exemplos de bases de dados biológicas de acesso livre, e que contêm dados de investigações reais, na Internet mas para esta actividade vamos usar dois recursos em particular.

O Centro Nacional para a Informação Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information; NCBI)^w1 em Bethesda, MD, EUA, oferece o acesso a informação biomédica e genómica, enquanto que o Instituto Europeu de Bioinformática (European Bioinformatics Institute; EBI)^w2, localizado nem Hinxton, Reino Unido, oferece dados de experiências em ciências da vida e realiza investigação básica em biologia computacional. A base de dados do NCBI vai oferecer-lhe a sequência de qualquer gene ou proteína que já tenha sido sequenciada e depois pode usar ferramentas do EBI para alinhar e analisar essas sequências.

Actividade

Quando se investigam as relações evolutivas entre diferentes organismos é importante escolher cuidadosamente que gene ou proteína vamos usar. Há exemplos bem conhecidos de genes homólogos que podem ser usados, como os genes que codificam as proteínas hemoglobina ou citocromo b, e nesta actividade vamos usar este último. O citocromo c é uma pequena proteína heme que é o componente central na cadeia de transporte de electrões na mitocôndria. Todos os organismos aeróbios evoluíram de um ancestral comum que usou o citocromo c pela primeira vez, por isso, para o nosso propósito, é uma boa escolha^w3.

Esta actividade desenvolve-se em três secções diferentes:

• encontrar as sequências de aminoácidos do citocromo c em diferentes organismos,
• alinhá-los, e
• construir uma árvore filogenética.

Por fim, incluem-se algumas questões para guiar a investigação sobre relações evolutivas.

Encontrar as sequências proteicas

1. Ir para a página web do NCBI^w1.
2. Na área de procura (search), no topo da página, seleccionar ‘proteína’ (‘protein’) do menu
3. Escrever o nome da espécie, por ex. Homo sapiens, e citocromo c.
4. Carregar no botão de procura (search).
5. Uma nova página vai apresentar uma lista com os resultados da sua procura. A maior parte deles são a mesma sequência proveniente de diferentes fontes mas outros podem ser sequências parciais ou sequências de espécies ou proteínas diferentes. Escolher cuidadosamente a proteína de interesse e carregar na ligação que se encontra por baixo, designada ‘FASTA’.
6. Da nova página que se carregou, copiar a cadeia de letras maiúsculas correspondente à sequência de aminoácidos. Colar as letras num documento Word não esquecendo de assinalar a sequência com o nome do organismo de onde vem.
7. Fazer o mesmo para o número de organismos que se pretenda, dependendo do que se quer investigar com os alunos. Pode querer incluir diferentes primatas para analisar a evolução humana ou organismos dos cinco reinos tradicionais para analisar de que forma a vida em geral evoluiu. Nesta actividade vamos usar 3 animais, 2 plantas, 2 algas, um fungo e um protozoário.

Alinhar as sequências

8. Ir para o sítio web do EBI^w2 e carregar em ‘Serviços’ (‘Services’). A seguir, escolher ‘proteínas’ (‘proteins’).
9. Carregar em Clustal Omega. Copiar o texto do documento Word e colar na caixa de texto designada ‘PASSO 1’ (‘STEP 1’).
10. Em PASSO 2 (STEP 2), escolher um formato para o alinhamento final, tal como ‘Clustal w/números’, que vai mostrar o tamanho de cada sequência. Por fim, carrear em ‘Submeter’ (‘Submit’) para completar o PASSO 3 (STEP 3).
11. O alinhamento das múltiplas sequências vai aparecer numa nova janela. A primeira coisa que se pode fazer é carregar no botão para mostrar as cores (‘show colours’). Esta opção dá a cada aminoácido a mesma cor e por isso é fácil identificá-los.
12. Para analisar o alinhamento, manter os seguintes símbolos na cabeça: um asterisco (*) significa que as sequências são idênticas naquela posição; dois pontos (:) indicam substituições conservativas (grupo da mesma cor); um ponto final (.) refere-se a substituições semi-conservativas (formas semelhantes). As cores agrupam os aminoácidos por características: vermelho para os aminoácidos pequenos, hidrofóbicos e aromáticos; azul para os ácidos; magenta para os básicos; verde para os hidróxil, amino, amido, básico; cinzento para os restantes.
13. Se carregar na opção ‘Sumários dos Resultados’ (‘Result Summary’), pode ver a percentagem de identidade conservada entre os diferentes organismos após o alinhamento. Nessa matriz encontra a percentagem de identidade de dois organismos para a sequência da proteína citocromo c. Adicionalmente, se tem o programa Java™ instalado no computador, pode usar o Jalview, um programa gratuito para editar, visualizar e analisar alinhamentos de múltiplas sequências. Com o Jalview será capaz de ver a sequência consensual para o citocromo c e o nível de conservação dos diferentes aminoácidos.

O software Clustal Omega tem muitas opções diferentes que envolvem um conhecimento matemático mais sofisticado do que o que é necessário para o propósito desta actividade. Se quiser saber mais sobre o Clustal Omega consulte o artigo de Sievers et al. (2011).

Fazer uma árvore Filogenética

14. Nos resultados do Clustal Omega, carregue no botão ‘Árvore filogenética’ (‘Phylogenetic tree’), localizado no fundo (vai precisar de ter o Java™ instalado).
15. Pode obter uma árvore filogenética ou cladística. Num cladograma o comprimento dos ramos na árvore é arbitrário enquanto numa árvore filogenética o comprimento dos ramos indicam o quanto a proteína evoluiu ao longo do tempo.

Para uma discussão mais aprofundada

1. As moléculas homólogas são um exemplo de evolução divergente. Como pode explicar a evolução divergente usando o citocromo c?
2. Os alinhamentos podem ser construídos usando sequências de nucleótidos (genes) ou de aminoácidos (proteínas). Porque será mais útil usar proteínas e não ADN para analisar relações evolutivas?
3. Numa árvore filogenética, um ‘clado’ é formado por todos os organismos que têm um ancestral comum mais recente. Dê um exemplo a partir do seu cladograma.
4. Que organismos sofreram um evento de especiação mais recentemente, de acordo com a análise filogenética do citocromo c? Qual é o número total de eventos de especiação?
5. Pensa que alguns aminoácidos terão mudado graças à mutação mas outros não; porquê? Pensa que os aminoácidos conservados não mudaram porque os seus codões não sofreram qualquer mutação?
6. Mostre alguns desses aminoácidos conservados no alinhamento. Investigue a sua função na Internet.

Agradecimentos

O autor gostaria de agradecer à sua colega María Isern pela ajuda na revisão da gramática do inglês deste artigo.

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