Descubriendo el ADN Teach article

Traducido por Isabel Carrero, Universidad de Valladolid. Dean Madden del Centro Nacional para la Educación en Biotecnología (National Centre for Biotechnology Education) de la Universidad de Reading, Reino Unido, describe cómo se descubrió el ADN – y cómo se puede extraer éste…

En 1868, Johann Friedrich Miescher se trasladó desde su Suiza natal a Tubinga, en Alemania. El joven de 24 años fue a estudiar en el laboratorio de Ernst Felix Hoppe-Seyler, un pionero de la bioquímica que dio el nombre actual al pigmento rojo de la sangre: hemoglobina. Tras varios meses de trabajo intenso en un laboratorio en los sótanos del castillo de Tubinga, Miescher consiguió aislar una sustancia ácida previamente desconocida a partir de células blancas de la sangre (leucocitos) obtenidas del lavado de vendas cargadas de pus procedentes de un hospital cercano. Miescher denominó a esa sustancia ‘nucleína’ debido a que se encontraba en el núcleo de las células. Sin embargo, la sustancia no era pura y Hoppe-Seyler insistió en repetir el trabajo él mismo antes de considerar la posibilidad de publicarlo en su recién creada revista de bioquímica.

Tras volver a su casa en Basilea en 1870, Miescher refinó el método y fue capaz de extraer material nuclear del esperma de salmón, pescado que, en aquellos tiempos, daba fama al Rin. Como ocurre en los leucocitos, el núcleo de las células espermáticas es relativamente grande. A partir de ellas, Miescher extrajo nucleína pura por primera vez. En 1889, un pupilo suyo, Richard Altmann, propuso la denominación actual para la nucleína: ácido nucleico. Así, en 2003, celebramos las bodas de oro de la doble hélice y no ‘los 50 años del ADN’.

Para un profesor de ciencias, el conocimiento de los métodos de Miescher es fascinante, sobre todo por las rudimentarias técnicas de las que disponía y la sorprendente similitud que tienen éstas con muchos de los protocolos para clase de hoy en día. En comparación con Miescher, sin embargo, los profesores actuales lo tienen más fácil. Sin refrigeración, Miescher tenía que empezar a trabajar a las 5 de la mañana para asegurarse de que los reactivos estuvieran suficientemente fríos para precipitar el ADN y tenía que preparar su propio extracto de proteasas a partir de los estómagos de cerdos recién sacrificados (Judson, 1996).

Protocolos para clase

El aislamiento de ADN de materiales comunes se ha convertido en una actividad muy habitual y extendida en los laboratorios escolares en los últimos 20 años. Aunque se habían descrito previamente protocolos prácticos similares (p.ej. Sands, 1970), muchos no estaban ampliamente extendidos debido a su complejidad y a la peligrosidad de algunos de los reactivos que utilizaban (Falconer & Hayes, 1986). Los métodos más sencillos para aislar el ADN aparecieron primero en los libros de texto americanos a mediados de los años 80 (p.ej. Helms et al., 1986) y posteriormente se fueron abriendo paso en proyectos escolares especializados en biotecnología (p.ej. Rasmussen & Matheson, 1990). A principios de los 90, esos métodos ya habían cruzado el Atlántico y aparecían en publicaciones en alemán e inglés (Bayrhuber et al., 1990; NCBE, 1991). Con la llegada de métodos sencillos y baratos, lo que eran ejercicios prácticos para alumnos universitarios o mayores de 16 años pasó a ser apropiado para alumnos más jóvenes, incluso de primaria (Assinder, 1998).

ADN de cebolla

El método más utilizado (si no, por razones obvias, el más popular) para extraer ADN requiere poco más que cebollas, detergente común y agua salada. Este método llegó a extenderse mucho en el Reino Unido debido a los talleres prácticos y las publicaciones del Centro Nacional para la Educación en Biotecnología (National Centre for Biotechnology Education) (NCBE, 1991; 1993). Métodos más sofisticados para extraer ADN de berros y guisantes secos fueron desarrollados por ‘Ciencia y plantas para las escuelas’ (Science and Plants for Schools) y el centro de educación ‘La máquina verde’ del CSIRO australiano (Australian CSIRO education centre ‘The Green Machine’) (NCBE, 2001), pero su inclusión de la electroforesis en gel del ADN hizo que estos protocolos quedaran restringidos a los estudiantes de más edad.

En la búsqueda de alternativas con un olor más agradable que el de la cebolla, se ha sugerido el aplicar el ‘método de la cebolla’ a distintas frutas como kiwi, plátano o fresas. Aunque estas frutas dan cantidades importantes de ADN, el ‘ADN’ producido es, de hecho, poco más que pectina. Esto se puede demostrar simplemente añadiendo pectinasa a la preparación (también es bastante fácil precipitar la pectina con alcohol, un viejo truco de los productores de mermelada).

ADN de guisantes

El protocolo que describimos aquí utiliza guisantes congelados. Esto tiene varias ventajas sobre el método tradicional de la cebolla. Primero, no se requiere licuadora para disgregar el tejido vegetal. Una vez que los guisantes se han descongelado, se pueden aplastar con una cuchara o con una varilla de vidrio. Segundo, los guisantes que quedan se pueden guardar en el congelador para irlos utilizando según se vayan necesitando. Por último, pero no lo menos importante, ¡los guisantes no huelen! El aislamiento del ADN (y de ARN) dura unos 35 minutos, incluyendo un periodo de incubación de 15 minutos.

Preparativos previos

El etanol debe estar helado. Para ello, ponerlo en una botella de plástico en el congelador al menos 24 horas antes de llevar a cabo esta actividad. Por favor, léase la nota de seguridad incluida más abajo.

Materiales y equipamiento necesarios por persona o grupo de trabajo

• Guisantes, unos 50 g (valen congelados pero hay que descongelarlos previamente)
• Detergente líquido común, 10 ml (no usar detergente concentrado)
• Tableta de sal, 3 g
• Agua destilada, 90 ml
• Etanol muy frío, unos 10 ml, directamente sacado del congelador (se puede utilizar alcohol desnaturalizado industrial, IDA, de ‘industrial denatured alcohol’, pero por favor véase la nota de seguridad inferior)
• Neutrasa (una proteasa) de Novozymes, 2-3 gotas
• Hielo en un recipiente con agua fría
• Filtros para café de papel (no usar papel de filtro de laboratorio, el líquido tarda mucho en atravesarlo)
• Jeringuilla de plástico de 1 ml (sin aguja)
• Embudo de plástico grande
• Dos vasos de precipitados de 250 ml
• Un tubo de ensayo de vidrio o un tubo graduado de plástico
• Una varilla de vidrio con el extremo plano o una cuchara para remover la mezcla
• Baño de incubación a 60ºC

Procedimiento

1. Disolver la sal en los 90 ml de agua destilada. Añadir el detergente líquido y mezclar suavemente.
2. Aplastar los guisantes con la varilla de vidrio o con la cuchara. Añadir el puré de guisantes a un vaso de precipitados con la disolución salina de detergente.
3. Poner el vaso con la mezcla en el baño a 60ºC durante exactamente 15 minutos. Este tratamiento hace que se rompan las membranas celulares de los guisantes.
   El detergente forma complejos con los fosfolípidos y las proteínas de la membrana haciendo que precipiten. Además, los iones sodio de la sal rodean los grupos fosfato con carga negativa de las moléculas de ADN y se produce su coalescencia. A 60ºC, las DNasas, enzimas que de otra manera podrían empezar a degradar el ADN, están parcialmente desnaturalizadas.
4. Enfriar la mezcla poniendo el vaso de precipitados en un baño de agua helada durante 5 minutos y removiendo con frecuencia.
   Esto reduce la rotura del ADN que se produciría si se mantuviera una alta temperatura.
5. Filtrar la mezcla sobre el segundo vaso de precipitados (nota del traductor: utilizar el embudo y el filtro de café para llevar a cabo la filtración). Asegurarse de que la espuma de la parte superior del líquido no contamina el filtrado.
   El filtrado contiene las proteínas solubles y el ADN.
6. Opcional: añadir 2-3 gotas de proteasa a unos 10 ml del extracto de guisantes y mezclar bien en el tubo de ensayo. (Nota del traductor: utilizar la jeringuilla para añadir la proteasa).
   La proteasa degradará proteínas de la preparación.
7. Verter muy cuidadosamente el etanol o el IDA helados por un lateral del tubo para que se forme una capa en la parte superior del extracto de guisantes.
8. Dejar reposar el tubo unos minutos.
   Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son insolubles en el etanol frío y precipitarán en la capa superior (etanólica).

Investigaciones adicionales

Para recuperar el ADN se puede hacer un gancho calentando un poco el extremo de una pipeta Pasteur en la llama de un mechero Bunsen y después curvando la punta antes de que el vidrio se enfríe. Para hacer una electroforesis del ADN, simplemente disolver un poco del extracto en unos 0,5 ml de tampón de carga con azul de bromofenol y después cargar unos 20 µl en un pocillo de un gel de agarosa al 1%. La tinción tras la electroforesis con una disolución de azur A al 0,04% (m/v) hará que se vean los ácidos nucleicos. El ARN muestra un color rosa más claro (Madden, 2000).

Variantes de este procedimiento de extracción se pueden usar para otros productos de partida, como esperma (lecha) o huevas de pescado (Strömberg, 2001). Varias publicaciones hacen referencia al uso de timo de ternera, pero a nivel escolar no se recomienda este material (véase la nota de seguridad más abajo).

Seguridad

El etanol en los congeladores

La mayoría de los congeladores no son a prueba de chispas eléctricas. En consecuencia, debes asegurarte de que el etanol se encuentra en el congelador en un contenedor sellado para que no escapen vapores. Una alternativa al congelador es colocar durante varias horas en hielo la botella de etanol sellada antes de ir a usarlo. Para más información acerca de la seguridad cuando se trabaja con ADN en la escuela, los profesores deberían consultar Topics in Safety (Delpech & Madden, 2001).

Uso de tejidos animales

Desde el descubrimiento de la encefalopatía espongiforme bovina y de variantes de la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en el Reino Unido, las autoridades para la seguridad escolar del país advirtieron de que el timo de ternera no debería ser usado en las escuelas puesto que hay riesgo (aunque pequeño) de exposición accidental al agente infeccioso durante la preparación del extracto.

Proveedores

La mayoría de los productos requeridos para este procedimiento se pueden obtener en un supermercado.
La neutrasa de Novozymes se puede comprar en pequeños volúmenes en el Centro Nacional para la Educación en Biotecnología (National Centre for Biotechnology Education) del Reino Unido.

Agradecimientos

Este artículo apareció primero en School Science Review en marzo de 2003.

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