Nach Genen fischen: DNA Mikroarrays in der Schule Teach article

Übersetzt von Veronika Ebert, Höhere Bundeslehr- und versuchsanstalt für chemische Industrie, Wien. Anastasios Koutsos, Alexandra Manaia, und Julia Willingale-Theune bringen eine ausgeklügelte molekularbiologische Technik in das Klassenzimmer.

Nach Genen fischen: eine Kurzgeschichte als sanfter Einstieg

Die Genexpression verfolgen: das analytische Potential von DNA Mikroarrays

In einer Zeit, in der die Sequenz des menschlichen Genoms (neben den Genomsequenzen vieler anderer Organismen) veröffentlicht worden ist, stellt sich die Herausforderung, die Bedeutung der einzelnen Gene aufzuklären. Dafür haben Wissenschaftler/innen ausgeklügelte Hilfsmittel entwickelt, zu denen der DNA Mikroarray gehört.

Unsere Geschichte vom Fischer ist frei erfunden, aber die Prinzipien, die der Mann genutzt hat, um die Zahl der Fische im Teich zu ermitteln, ähneln jenen, die bei DNA Mikroarrays eingesetzt werden. Diese Technologie hat die Art und Weise, wie Wissenschafter/innen lebende Prozesse sehen, revolutioniert.

Bis in die 1990er Jahre konnten Biologen nur die Aktivität einiger weniger Genen gleichzeitig messen. Ein Gen ist dann aktiv, wenn es in sein Botenmolekül, die mRNA übersetzt wird. Diese mRNA wird anschließend genutzt, um eines oder mehrere Proteine herzustellen.

Enttäuscht über die Tatsache, dass es unmöglich war, die Expression aller Gene in einer Zelle gleichzeitig zu verfolgen, begannen Wissenschaftler/innen nach Wegen zu suchen, dies dennoch zu erreichen. Dabei muss ermittelt werden, wie viele mRNA´s zur gleichen Zeit in einer Zelle vorhanden sind, und zu welchem Gene sie gehören. Diese revolutionäre Idee gipfelte in der Entwicklung der Mikroarrays. Die Wissenschaftler/innen schufen etwas, das den 20 000 Angelschnüren in unserer Geschichte entspricht.

Sie verwendeten ein Stück vorbehandeltes Glas, ähnlich aussehend wie ein Objektträger für die Mikroskopie und fixierte Abschnitte einzelsträngiger DNA auf der Oberfläche. Dabei entsprach jeder DNA-Abschnitt einem einzigen Gen. Diese DNA-Stränge wirkten dann als Köder für das zum jeweiligen Gen zugehörige mRNA-Molekül, genauso wie ein bestimmter Köder eine bestimmte Fischart anlockt. Mit freiem Auge betrachtet wirken diese Gruppen von DNA-Strängen wie kleine Punkte. Jedes Glasplättchen wird mit tausenden solcher Punkte in regelmäßiger Anordnung bedruckt, man spricht dann von einem Mikroarray.

Mikroarray-Experimente können sehr zeitaufwändig sein. Zuerst müssen die Plättchen von den Wissenschaftler/innen vorbereitet werden, dann muss die Information tausender Punkte ausgewertet werden. Die Analyse erfordert mathematische und statistische Expertise, und kann Monate dauern. Um die zu Grunde liegenden Konzepte dieser Technologie im Unterricht illustrieren zu können, ist die Verwendung eines Modells zweckmäßig.

Das reale und das virtuelle Mikroarray-Experiment Schritt für Schritt

Der virtuelle Mikroarray ^w1der vom European Learning Laboratory for the Life Sciences (ELLS)^w2 am European Molecular Biology Laboratory^w3entwickelt worden ist, beschreibt eine Unterrichtsaktivität, die ein Mikroarray-Experiment mit Alltagsmaterialien nachstellt. Das Spiel simuliert die verschiedenen Arbeitsschritte der Wissenschaftler/innen bei der Durchführung und Auswertung von Mikroarray-Experimenten. Es eignet sich für 16-18-Jährige, und kann als ergänzende Aktivität bei den Themengebieten Genetik, Zellentwicklung und Erbkrankheiten eingesetzt werden.

Die nachfolgende Anleitung beschreibt Schritt für Schritt, wie ein wirkliches Mikroarray-Experiment durchgeführt wird, und, parallel dazu, die Schritte des virtuellen Mikroarrays. In dieser Unterrichtsaktivität wird der virtuelle Mikroarray verwendet, um die Unterschiede in der Genexpression einer normalen Zelle und einer Krebszelle festzustellen. Technische Informationen und Empfehlungen für die Durchführung des virtuellen Mikroarray-Experiments in der Klasse können von der ELLS TeachingBase (‘In the classroom’ PDF)^w1 herunter geladen werden.

Wenn alles vorbereitet ist, benötigt man für die Basisaufgabe etwa eine Stunde. Die anschließende Auseinandersetzung mit der Thematik kann entweder in der Klasse als Diskussion stattfinden, oder als Hausaufgabe aufgegeben werden.

Materialien

• Eine Matte, die groß genug ist, um für 10 Kreise (je 35 cm Durchmesser), die die DNA-Flecken repräsentieren, Platz zu bieten
• 5 rote, 5 grüne und 5 gelbe Kreise mit je 35 cm Durchmesser, aus gefärbter Plastikfolie oder Papier
• Ein Stift, um die Kreise zu zeichnen und zu beschriften
• Klettverschluss-Streifen in verschiedenen Farben (eine Farbe pro Gen); können durch Einfärbung weißer Klettverschluss-Streifen mit Filzstiften selbst hergestellt werden
• 33 grüne und 34 rote Lämpchen mit etwas Reserve. Wir verwenden Werbeblinklichter, die relative preiswert sind. Alternativ können Schüler/innen ihre eigenen Taschenlampen mitbringen und mit rotem oder grünem Papier abdecken. Es kann zweckmäßig sein, den Griff der Lampe in ein kleines Gefäß zu stellen, damit das Licht vom Boden zur Decke strahlt. Varianten, bei denen weniger Lampen erforderlich sind, findet man auf der ELLS TeachingBase (‘In the classroom’ PDF)^w1.
• 2 Schachteln, die je 35 Lampen Platz bieten
• Ausdrucke der Tabelle 1 (können im Internet herunter geladen werden ^w4).

Der Raum sollte abgedunkelt werden können (Vorhänge oder Rollos).

Herstellung

Real

DNA-Mikroarrays werden auf kleine Glasplättchen, die Objektträgern für die Mikroskopie ähneln, aufgedruckt. Da es sehr schwierig ist, kleine Tropfen per Hand auf eine Glasoberfläche aufzusetzen, wurden spezielle Druckroboter entwickelt. Ihre Druckköpfe haben spezielle Spitzen, mit denen die wässrige DNA-Lösung von einem Reservoir in regelmäßiger Anordnung auf das Glas übertragen werden können. Durch die Steuerung des Roboters können alle Eigenschaften des Arrays bestimmt werden: die Zahl und Größe der Punkte, sowie der Abstand zwischen den Punkten. Pro Glasplättchen können bis zu 20 000 Flecken aufgedruckt werden, jeder Punkt enthält Millionen Kopien eines DNA-Moleküls, das für ein bestimmtes Gen kodiert.^w4.

Virtuell

1. 10 Kreise mit etwa 35 cm Durchmesser auf die Matte zeichnen (diese entspricht den DNA-Punkten im Realfall)
2. Jeden Kreis entsprechend den Angaben in Tabelle 1 bezeichnen (jedes Gen trägt den Namen eines/r berühmten Wissenschaftlers/in)
3. Die der 2.Spalte in Tabelle 1 entsprechende Zahl von Klettverschluss-Streifen der jeweiligen Farbe (weiche Seite nach oben) in den entsprechenden Kreis legen (es macht nichts, wenn nicht benötigte Klettverschluss-Streifen übrig bleiben). Die Klettverschluss-Streifen entsprechen den DNA-Strängen, und jede Farbe repräsentiert die DNA eines bestimmten Gens. Die Farben in der Tabelle notieren.

mRNA Extraktion

Real

Der erste Arbeitsschritt eines realen Mikroarrayexperiments ist die Reinigung der mRNA aus den Zellen beider Untersuchungsstadien z.B. aus normalen Zellen und aus Krebszellen. Die mRNA wird mit herkömmlichen Labormethoden gereinigt und anschließend mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, z.B. grün für jene aus normalen Zellen, und rot für jene aus Krebszellen.

Virtuell

Die fluoreszenzmarkierte mRNA wird durch kleine Lampen repräsentiert. Jede Lampe entspricht dem Einzelstrang einer mRNA eines bestimmten Gens. Grüne Lampen repräsentieren mRNA, die aus normalen Zellen extrahiert worden ist, rote Lampen jener aus Krebszellen.

1. Farbige Klettverschlusstreifen (Teile mit der harten Fanghakenleiste) entsprechend den zahlenmäßigen Angaben in Tabelle 1 auf die Unterseite der grünen und roten Lampen fixieren, dabei für jedes Gen Klettverschluss-Streifen einer Farbe verwenden.
2. Ein paar Extralampen entweder mit mehrfärbigen Klettverschluss-Streifen, oder mit einer Farbe, die bisher nicht verwendet worden ist, markieren. Diese repräsentieren mRNA-Moleküle, die entweder nur schwach, oder gar nicht an die DNA, also die 10 Gene (Matte), binden.
3. Alle grünen Lampen in eine Schachtel legen (normale Zellen), alle roten in eine andere Schachtel (Krebszellen).

Hybridisierung

Real

Bei der Hybridisierung werden die Kontroll-mRNA- (grün) und die Test-mRNA-Lösungen gemischt, und auf die Oberfläche eines Mikroarrays aufgebracht, damit sie an die komplementären, immobilisierten DNA-Stränge binden können. mRNA-Moleküle, deren Sequenz keine Komplementarität zu einem Gen haben, werden nicht binden. Jene, die teilweise komplementär sind, werden schwach binden (unspezifische Hybridisierung). Letztere werden durch einen nachfolgenden Waschschritt entfernt.

Virtuell

1. Lämpchen (mRNA-Moleküle) aus den Schachteln (Zellen) nehmen, und an jene Stelle der Matte, deren Farbe jener des Klettverschluss-Streifens entspricht legen bzw. stellen.
2. Einige mRNA-Moleküle haben Farben, die zu keinem Gen passen, andere haben mehrfarbige Klebestreifen, die nur schwach an einigen Genen haften.
3. Alle ungebundenen und schwach gebundenen Lämpchen durch einen virtuellen Waschschritt entfernen.

Scannen

Real

Jetzt ist es Zeit, die Ergebnisse des Experiments zu erfassen, um zu erkennen, welche mRNA mit einem Gen hybridisiert hat. Da mRNA-Moleküle mit freiem Auge nicht sichtbar sind, kann die Menge der gebundenen mRNA durch die Messung der Fluoreszenz jedes Flecks nur indirekt ermittelt werden. Dazu wird ein spezieller Laser verwendet. Die rote und grüne Fluoreszenz wird unabhängig voneinander gemessen, und zwei Bilder erzeugt. Durch Überlagerung dieser beiden Bilder erhält man ein charakteristisches Muster von färbigen Punkten (siehe Abbildung rechts). Ein roter Punkt zeigt, dass das Gen in der Krebszelle, ein grüner Punkt, dass es in der normalen Zelle aktiv ist. Ein gelber Punkt bedeutet, dass das entsprechende Gen in beiden Zellen gleich aktiv ist.

Virtuell

1. Lampen einschalten und Raum verdunkeln.
2. Die Schüler/innen auffordern, zu beschreiben, was sie bei jedem einzelnen Gen sehen. Wie viele grüne und rote Lampen hat jedes Gen? Anders ausgedrückt: Unterscheidet sich die mRNA Expression zwischen normalen Zellen und Krebszellen? Anmerkung: wenn die gleiche Zahl von roten und grünen Lampen in jedem Kreis vorhanden ist, ist die Genexpression unverändert. Die Schüler/innen zu eigenen Schlussfolgerungen anregen.
3. Den Schüler/innen erklären, dass die Stärke des roten, grünen und gelben Lichts von der Menge der mRNA in der jeweiligen Zelle abhängt. Anmerkung: die Mischung von rotem und grünem Licht ergibt gelb. Bei Farben ergibt die Mischung von rot und grün lila.
4. Lampen abschalten und die gefärbten Kreise austeilen. Die Schüler/innen fragen, welche Punkte in einem realen Mikroarray rot, grün, oder gelb leuchten würden, abhängig von der Zahl der Lampen.

Analyse

Real

Die Analyse des Mikroarray-Experiments beginnt mit der Messung der Fluoreszenzintensität der einzelnen Punkte. Dies bewerkstelligt ein Scanner automatisch. Obwohl sich die Analyse des erhaltenen Bildes in verschiedenen Experimenten unterscheidet, wird häufig damit begonnen, die Gene, die ein ähnliches Verhalten aufweisen, zu gruppieren, das nennt man „Clustern“. Nach dem Clustern versuchen die Wissenschafter/innen Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Genen eines Clusters heraus zu arbeiten.

Virtuell

1. Die Schüler/innen auffordern, mit Hilfe der Tabelle 1 Gene in Gruppen mit einem ähnlichen Verhalten im Mikroarray aufzuteilen. (siehe ‘Teacher’s guide to clustering exercises’ und ‘Clustering exercises for the classroom’ in der ELLS TeachingBASE^w1).
2. Die unterschiedlichen Möglichkeiten, Gene zu gruppieren, diskutieren. Den Schüler/innen erklären, dass es keine richtige oder falsche Art der Gruppierung gibt, aber dass die Schlüsse, die man aus einer bestimmten Gruppierung ziehen kann, unterschiedlich sein können.
3. Die Schüler/innen auffordern, sich Informationen über jene Wissenschaftler/innen zu beschaffen, nach denen die Gene benannt worden sind, damit sie Gemeinsamkeiten der Gene eines Clusters entdecken können.

Je nach Gruppierungsmethode findet man entweder eine Gruppe von Wissenschaftler/innen, die die Doppelhelix entdeckten, eine Gruppe von Genetiker/innen, eine Gruppe von Wissenschaftler/innen, die mit Mikroorganismen arbeiten, oder Wissenschafter/innen, die für die Gründung des Molecular Biology Laboratory verantwortlich waren.

Abschluss

Nach Durchführung des Mikroarray-Experiments können Schüler/innen über die Verwendung von Mikroarray-Experimenten in der biomedizischen Forschung und medizinische und ethische Auswirkungen dieser Technologie diskutieren. Weiterführende Informationen gibt es im „Reading club“ (Leseklub) in der ELLS TeachingBASE^w1, in dem Original-Forschungspublikationen abrufbar sind, die die Verwendung von Mikroarrays zur Beantwortung wichtiger biologischer Fragestellungen beschreiben.

Danksagungen

Die Autoren/innen danken Rosanna de Lorenzi für das Spielen und die Verfeinerung des Spiels. Sie danken auch Mehrnoosh Rayner für die Kommentierung des Artikels, Thomas Sankmann für die Hilfe zu Beginn der Entwicklung des Mikroarrays, und John Watson für hilfreiche Diskussionen.

Web References

• w1 – weitere Informationen zum virtuellen Mikroarray finden sich auf der TeachingBASE auf der ELLS Webseite in Englisch, Deutsch und Griechisch. Die Webseite bietet eine frei zugängliche Sammlung von molekularbiologischen Unterrichtsmodule für Lehrer/innen und Schüler/innen: www.embl.org/ells
• Die folgenden PDF-Files im Abschnitt über virtuelle Mikroarrays sind besonders wichtig für diesen Artikel:
  • In the classroom
  • Reading club
  • Teacher’s guide to clustering exercises
  • Clustering exercises for the classroom
• w2 – Weitere Informationen über das European Learning Laboratory for the Life Sciences (ELLS) finden sich unter: www.embl.org/ells
• w3 – Weitere Informationen über das European Molecular Biology Laboratory, finden sich unter: www.embl.org
• Hier kann das Word-Dokument der Tabelle 1 herunter geladen werden

Institutions

License

CC-BY-NC-SA