Tradus de Monica Dobre

11 nucleoproteine (in culori diferite) se leaga de o molecula de ARN (negru) pentru a forma un complex Pentru imagine, mulţumim Winfried Weissenhorn

Grupul lui Winfried Weissenhorn de la Laboratorul European de Biologie Moleculara (European Molecular Biology Laboratory) din Grenoble, Franta, a descoperit o modalitate de a aborda problema unei serii de virusi periculosi – prin izolarea acestora in proprii coconi. Claire Ainsworth investigheaza. Este, probabil, una dintre cele mai temute boli din lume. Odata ce apar, simptomele clasice – balbaiala, salivarea, frica de apa, paralizia – aproape intotdeauna duc la moarte. Doar cinci oameni au supravietuit asaltului rabiei, si toti in afara de unul au suferit afectiuni neurologice permanente. Desi vaccinarea si tratamentele post-expunere preventive au redus dramatic impactul bolii in Europa si America de Nord, inca nu exista nici un leac. Turbarea (rabia) ramane o amenintare serioasa in multe tari in curs de dezvoltare, omorand pana la 70 000 de oameni annual.

Ingrijorator e faptul ca turbarea si virusi asemanatori ar putea sa reapara in tarile dezvoltate, raspanditi printre oameni de contactul cu liliecii. Asadar, descoperirea de catre Winfried Weissenhorn, Rob Ruigrok si a colegilor lor a unui mod de a aborda acesti virusi este foarte oportuna. Echipele, bazate la Laboatorul European de Biologie Moleculara (European Molecular Biology Laboratory) in Grenoble, Franta, si la Unitatea pentru Interactia Celulelor-Gazda ale Virusilor (eng. Unit for Virus Host Cell Interactions - UVHCI), au descoperit structura unei proteine care inchide intr-un cocon materialul genetic al virusului si il ascunde de sistemul imunitar al corpului pana cand acesta are ocazia de a se autocopia. Este posibila folosirea medicamentelor pentru a bloca genomul in interiorul acestei gogosi protectoare, prevenind astfel raspandirea virala.

Dar aceasta activitate are implicatii dincolo de domeniul exclusiv al rabiei. Se pare ca multi alti virusi, precum virusii Ebola, al bolii Borna si al pojarului, au coconi similari pentru genomii lor, fapt care ar putea ajuta la determinarea originii si a felului in care au evoluat virusii. Virusul rabiei, ca si alti virusi, isi formeaza genomul dintr-o singur lant de ARN, o molecula similara ADN-ului ce poarta genele noastre. Dar, spre deosebire de ADN, informatia codata de ARN-ul virusului nu poate fi direct folosita pentru a construi proteinele necesare formarii virusului. In schimb, este o copie complementara, un fel de negativ fotografic chimic, al secventei necesare. Asadar, inainte ca virusul sa poata face proteinele ce constituie cochilia protectoare a genomului, mai intai trebuie sa converteasca acest “lant negativ” de ARN in unele “pozitive”care pot fi transformate in proteine. De asemenea, are nevoie de mai multe copii ale genomului sau pentru a le transforma in mai multi virusi.

Winfried Weissenhorn Pentru imagine, mulţumim EMBL Photolab

Pentru virus, aceste procese sunt pline de riscuri. Celulele mamare, inclusiv celulele umane, contin sisteme de aparare care ataca si distrug ARN-ul strain. Asa ca virusul isi ascunde genomul vulnerabil prin infasurarea lui stransa intr-o nucleocapsida, un invelis facut dintr-o proteina numita nucleoproteina, care sa il protejeze pana cand ajunge in interiorul celulei unde ataca masina celulara a gazdei pentru a se replica si a produce proteine virale. Pe langa apararea genomului, nucleoproteina ajuta la controlul balantei dintre productia de proteine necesare replicarii virale si procesul de replicare in sine, pentru ca nu se pot avea loc amandoua simultan. In acest fel, nucleocapsida joaca un rol cheie in viata virusului.

Totusi, pana acum, singurele indicii ale oamenilor de stiinta privind functionarea nucleoproteinelor erau din imaginile neclare ale microscopului electronic care aratau cum moleculele nucleoproteinelor polimerizau pe genom ca sa formeze nucleocapside, dar aratau prea putin din structura proteinei. Pentru a afla mai multe, Rob Ruigrok de la UVHCI si Winfried Weissenhorn au colaborat pentru a face cristale de nucleoproteina si sa determine structura acesteia folosind fasciculele de raze X de mare intensitate disponibile de la Instalatia Europeana de Radiatia a Sincrotronului (European Synchrotron Radiation Facility), ce se afla tot in Grenoble. Cristalele sunt structuri simetrice si, cand sunt expuse la fascicule de raze X, produc o imagine de difractie foarte ordonata, din care cercetatorii pot deduce forma precisa a unei molecule. Prin determinarea structurii nucleoproteinei, oamenii de stiinta vor putea incepe proiectarea medicamentelor ce ar putea incuia genomul viral in cochilia sa protectoare.

Proiectul a inceput in laboratorul lui Rob, unde echipa sa lucra pe nucleoproteinele unui numar de lanturi negative de ARN inca din mijlocul anilor '90. Rabia s-a dovedit a fi doar virusul cu care se poate lucra cel mai usor. Aurélie Albertini, un doctorand din laborator, a reusit sa faca celulele de insecte din cultura sa produca nucleoproteina de rabie. Proteina s-a infasurat in jurul moleculelor de ARN ale celulelor-gazda, formand inele continand 9 - 13 molecule de proteine. Grupul lui Rob Ruigrok aflase anterior ca acestea se comportau ca niste nucleocapside in miniatura, si studiile la microscopul electronic au aratat detalii brute ale structurii lor, ceea ce a dezvaluit ca acestea sunt asemanatoare nucleoplasmidei rabiei si astfel ar putea fi folosite in cercetarea structurii nucleoproteinei aranjate in jurul ARN-ului.

Sase nucleoproteine (in culori diferite) se leaga margine de margine de o molecula de ARN (negru). Proteina este formata din doua parti principale: CTD, care protejeaza o parte a ARN-ului si care se lipeste si de CTD-urile altor nucleoproteine, si NTD, care se afla de cealalta parte a ARN-ului si nu face contact extensiv cu celelalte nucleoproteine. Apasa pe imagine pentru marire Pentru imagine, mulţumim Winfried Weissenhorn

Aurélie a inceput sa lucreze la producerea cristalelor de ARN-nucleoproteina, un proiect la care s-a alaturat mai tarziu Amy Wernimont, un postdoc in laboratorul lui Winfried. Dar moleculele nu au fost prea cooperante si atat Aurélie cat si Amy s-au luptat mult timp pentru a obtine cristalele care i-ar fi permis lui Amy sa determine structura la o rezolutie de 4 Ångström, care este suficienta pentru a distinge cum se pliaza proteinele, dar nu suficient pentru a arata secventa de aminoacizi, blocurile individuale componente ale proteinei. Una din probleme a fost aceea ca celulele cu care lucra produceau cantitati foarte mici de nucleoproteina.

Din fericire, instalatia de cristalizare a materialelor inalte a lui Josan Márquez era la indemana pentru a ajuta la rezolvarea problemei, folosind numai probe mici de proteine. “Instalatia de cristalizare a fost pur si simplu minunata”, isi aminteste Winfried. “Daca am fi avut nevoie de probe mari, nu am fi indeplinit conditiile pentru cristalizare.” Echipa a gasit pana la urma conditiile optime, concentratia exacta a proteinei si un amestec complex de substante chimice necesare cristalizarii, si au reusit sa le potriveasca astfel incat sa obtina o rezolutie de 3,5 Ångström – suficient cat sa construiasca un model detaliat al structurii proteinei. Au beneficiat de ajutor si din partea lui Raimond Ravelli, care a asistat colectarea de date, reglarea fina a timpului de expunere la raze X pentru a obtine cele mai bune rezultate si a oferit consiliere continua in diverse stadii ale investigatiilor in structura proteinei.

Acest model de nucleoproteina arata cum ARN-ul este complet acoperit la interfata cu NTD (deasupra) si CTD (dedesubt) si astfel nu este accesibil enzimelor de descompunere ale gazdei, sau polimerazei Pentru imagine, mulţumim Winfried Weissenhorn

Rezultatele au aratat ca nucleoproteina se aglomereaza complet in jurul ARN-ului, izolandu-l precum bijuteriile familiei intr-un seif de banca. “Nu este acccesibil nici unei alte enzime pentru a-l ataca”, spune Winfried. Proteina este formata din doua parti principale, sau domenii. Un domeniu, numit CTD, protejeaza o parte a ARN-ului si se ataseaza de CTD-ul altor molecule de nucleoproteina, ajutand la formarea unui cocon spiralat. Celalalt domeniu, NTD, se afla de cealalta parte a ARN-ului si nu face contact extensiv cu celelalte nucleoproteine. Structura generala este ca un surub in jurul ARN-ului, ce tine orice altceva in afara. “Nucleoproteina va feri ARN-ul sa fie recunoscut de sistemul imunitar intern al organismului”, spune Winfried. “Dar cum devine el accesibil pentru replicare si translatie?” Raspunsul se afla in doua structuri ca niste siruri care ies din fiecare domeniu. Acestea ar putea actiona ca niste balamale, deplasand regiune NTD in sus si deschizand invelisul de nucleoproteina, astfel incat sa permita accesul enzimelor virale unor portiuni mici ale genomului la un moment dat. O anumita proteina, numita fosfoproteina P, ar putea fi implicata. Leaga polimeraza ARN, enzima necesara copierii genomului, de nucleoproteina, si s-ar putea atasa uneia dintre balamale pentru a inlatura NTD-ul din cale.

Acest mecanism de balamale sugereaza un mod de a aborda virusii precum rabia cu medicamente care interfereaza cu acesta. “Daca ipoteza noastra ca acesta se deschide este corecta, l-am putea bloca pe pozitia inchis”, spune Winfried. “Acest fapt ar bloca replicarea virala.” Incuiat in interiorul propriului invelis din proteina, genomul viral ar fi lipsit de putere si apoi eliminat din celula. Urmatorul pas spre asemenea medicamente ar fi o cautare sistematica pentru substante chimice mici cu proprietatea de a se atasa balamalelor, blocand astfel deschiderea nucleocapsidei.

Descoperirea ar putea ajuta la intelegerea felului in care au evoluat virusii cu lant negativ de ARN, declara Winfried. Specii de virusi inruditi pot avea secvente genetice foarte diferite, facand dificila tragerea unor concluzii despre istoria lor evolutiva doar din compararea secventelor. Pe de alta parte, structurile sunt cu totul altceva. Aceeasi structura fizica poate fi construita dintr-o varietatea de gene si secvente de aminoacizi. Asadar, chiar daca genele evolueaza si se schimba dramatic, structurile pe care le codeaza pot dezvalui legaturi evolutionare profunde intre virusi.

Pozele moleculelor de ARN la microscopul electronic ale altor virusi cu lant negativ de ARN, precum virusul pojarului, virusul Marburg si structura cristalina a virusului Borna, sugereaza ca nucleoproteinele lor au o structura protectoare cu balamale similara. Aceasta indica faptul ca virusii folosesc o tactica similara virusului rabiei pentru a-si proteja ARN-ul, si astfel ar putea fi tintiti de medicamentele care blocheaza usile coconilor lor astfel incat sa ramana inchise. De asemenea, sugereaza ca au un stramos comun, spune Winfried. “Din analiza secventei, nu ai crede ca sunt inruditi”, adauga el. “Cred ca a fost probabil o nucleocapsida ancestrala, dar apoi au evoluat pe cai divergente ca virusi ce infecteaza diverse tipuri de celule.”

Resurse

Munca descrisa in acest articol a fost publicata ca:
Albertini AA, Wernimont AK, Muziol T, Ravelli RB, Clapier CR, Schoehn G, Weissenhorn W, Ruigrok RW (2006) Structura cristalina a complexului nucleoproteina-RNA a virusului rabiei (eng. Crystal structure of the rabies virus nucleoprotein-RNA complex). Science 313: 360-363.

Pentru a afla mai multe despre activitatea lui Winfried Weissenhorn si a lui Rob Ruigrok, vedeti www2.ujf-grenoble.fr/pharmacie/laboratoires/gdrviro/